两种柑橘物种中WRKY转录因子的鉴定和比较-文献精读82

Genome-wide identification and comparative expression profiling of the WRKY transcription factor family in two Citrus species with different Candidatus Liberibacter asiaticus susceptibility

全基因组范围内鉴定和比较两种对柑橘黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）抗性不同的柑橘物种中WRKY转录因子家族的表达谱

摘要

背景水杨酸（Salicylic Acid, SA）是一种重要的植物激素，在由各种病原体（如引起黄龙病（Huanglongbing, HLB）的柑橘黄龙病菌 Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas)）触发的植物先天免疫中起关键作用。WRKY是一类植物特有的转录因子（TF）家族，在植物应对生物胁迫中具有重要功能。尽管多种柑橘物种的基因组已经被解析，但WRKY家族在水杨酸处理和CLas感染条件下的进化历史、功能和表达模式在柑橘中的研究仍然不足，因此需要对该家族进行全面的基因组和表达分析。

结果本研究对两种柑橘物种——甜橙（Citrus sinensis，对HLB敏感）和枳（Poncirus trifoliata，对HLB耐受）中的WRKY转录因子进行了全基因组范围的鉴定。共鉴定出52个甜橙WRKY基因（CsWRKYs）和51个枳WRKY基因（PtrWRKYs）。对这些基因的物理和化学性质、染色体位置、系统进化关系及结构特征进行了比较分析。特别地，还比较了这些WRKY基因在水杨酸处理前后及CLas感染前后的表达模式。基于分析结果，筛选出在两种柑橘物种中表现出相反表达模式的7对直系同源WRKY基因。此外，发现2对直系同源WRKY基因的启动子区域在胁迫响应顺式作用元件的数量或类型上存在显著差异。亚细胞定位和转录激活活性分析表明，这两对直系同源基因是经典的WRKY转录因子，定位于细胞核内并可能作为转录激活因子发挥作用。

结论本研究系统分析了两种柑橘物种中WRKY家族的基因组特征，并结合水杨酸信号和CLas感染条件下的表达模式进行了研究。我们的研究为进一步探究WRKY转录因子在柑橘HLB响应和水杨酸信号途径中的功能奠定了基础。

引言

黄龙病（Huanglongbing, HLB），通常被称为柑橘黄化病，是一种对柑橘生长造成严重阻碍并威胁全球柑橘产业的灾难性病害 [1]。目前已确定三种“候选解淀粉芽孢杆菌”物种为HLB的致病因子，分别是“候选解淀粉芽孢杆菌亚洲型”（Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas）、“候选解淀粉芽孢杆菌美洲型”（Candidatus Liberibacter americanus）和“候选解淀粉芽孢杆菌非洲型”（Candidatus Liberibacter africanus），其中CLas分布最广且危害最大 [2]。两种取食韧皮部的柑橘木虱，即亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri, ACP）和柑橘非洲木虱（Trioza erytreae），是HLB相关细菌的天然传播媒介 [3]。一旦柑橘感染CLas，会表现出一系列典型症状，包括叶片出现黄绿斑点、小枝停止生长、果实畸形以及种子败育。最终，随着病害的加重，柑橘树将逐渐死亡 [4]。

至今，尚无根治HLB的有效方法。几乎所有的柑橘品种都会受到HLB相关细菌的影响，且未发现明确的抗性 [5]。然而，不同柑橘品种的初步分析表明，宿主对CLas的反应存在差异 [6]。研究表明，与树基部萌发的砧木枝条相比，许多枳橙及其杂交种对HLB的症状表现较轻 [7,8,9]。此外，研究发现，一些枳橙材料通过影响木虱的产卵和寿命，对ACP具有抗性 [10,11]。因此，枳橙可能在一定程度上对CLas感染或木虱定殖具有耐受性。

水杨酸（SA）是一种广泛存在于植物中的酚类化合物，同时也是一种重要的植物激素，调控着多种胁迫响应和生理过程，包括免疫反应、种子萌发、生长发育、气孔关闭和衰老等 [12]。其中，水杨酸在植物抗病免疫中的作用已被广泛研究。水杨酸信号通路构成了一个紧密关联的调控级联，发挥关键作用于建立系统获得性抗性（SAR），一种在局部病原体感染后作用于整个植物的长期广谱抗性机制 [13]。植物感染病原体后，水杨酸含量迅速升高，可运输到不同的组织和器官，最终引发一系列SAR抗性反应，例如病程相关基因的表达、水杨酸与抗病蛋白以及其他相关基因通过信号传递的相互作用。近期研究表明，水杨酸抗性信号通路是一个复杂的网络，其中多种转录因子（TFs）参与了病原体侵染后的基因表达调控 [14,15]。

WRKY转录因子（TFs）在植物基因组中数量众多，是调控众多植物过程的关键网络组成部分 [16,17,18,19]。WRKY转录因子的命名源自其蛋白质的显著特征，即WRKY结构域，这是一段含有约60个氨基酸的高度保守区域，核心序列为N端的WRKYGQK，同时伴有C端类似锌指的新型结构域 [20]。根据WRKY结构域的数量及锌指基序的特性，WRKY蛋白被分为三大类和八个亚类。N端（Ia组）或C端（Ib组）具有两个WRKY结构域的蛋白被归为I类，而仅有一个WRKY结构域的则属于II类或III类。WRKY转录因子通过结合目标基因启动子区域的W-box顺式元件 [T/C)TGAC(T/C)]，调控相关基因的表达 [21]。大量研究表明，WRKY转录因子参与了多种生物和生理过程，包括抗病反应 [22,23]。例如，辣椒中的IIb亚组WRKY家族成员CaWRKY6通过激活另一个WRKY基因CaWRKY40，对黄萎病菌（Ralstonia solanacearum）的抗性起积极作用 [24]。在水稻中，OsWRKY62作为一种固有免疫的负调控因子，通过影响基础免疫和Xa21介导的水稻特异性防御响应，对细菌性病原体稻瘟病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）起作用 [25]。总之，WRKY家族在不同植物中数量庞大，分布多样，并且在病原攻击下具有不同的调控机制。

尽管一些WRKY转录因子在植物抗病防御中的功能已被鉴定，但多数WRKY的分子机制及其调控作用，尤其是在非模式植物中的作用，仍然知之甚少。本研究通过对已公开的基因组数据库进行生物信息学分析，对两种柑橘属植物（甜橙和枳橙）的WRKY转录因子进行了全基因组分析。研究包括多序列比对、系统发育关系、染色体分布、基因复制和WRKY基因的同线性关系。此外，还分析了两种柑橘WRKY直系同源基因在水杨酸处理和CLas感染下的表达模式，研究了七对具有强烈相反表达模式的直系同源WRKY基因启动子中的胁迫响应顺式元件。此外，还研究了两对具有不同启动子元件的直系同源WRKY基因的亚细胞定位和转录激活活性。本研究为柑橘WRKY家族的特性及其在黄龙病响应中的功能研究提供了前瞻性知识。

方法

植物材料与生长条件

两种柑橘品种，甜橙 (Citrus sinensis) 和枳橙 (Poncirus trifoliata)，在中国赣州的赣南师范大学的容器中种植。每种品种的三个月龄植株在16小时光照和8小时黑暗的条件下，25°C的温度下生长。2 mM水杨酸（SA）溶液用于灌溉盆栽土壤，并喷洒枝条和叶片。每盆施用相同剂量。在指定时间点收集叶片，立即置于液氮中冷冻并储存于-80°C，用于基因表达分析。此外，收集甜橙和枳橙的叶片用于RNA提取和cDNA模板的制备，进一步用于基因克隆和载体构建。烟草 (Nicotiana benthamiana) 植株也在相同生长条件下的盆栽土壤中种植，用于后续的瞬时转化实验。每种条件下，从三个不同的盆栽中随机取样三片叶子（一盆取一片叶子）作为重复。

每种柑橘品种的两年生植株通过带有黄龙病（HLB）症状甜橙植株的腋芽嫁接进行接种，这些腋芽嫁接于植株的主干上。每株植株至少嫁接三个腋芽。来自健康植株的腋芽用作对照嫁接至两种柑橘品种。所有植株在温室中培育，平均温度为25°C。在接种后三个月随机收集叶片和叶柄用于DNA分离和RNA提取，每次实验有三个生物重复。

甜橙和枳橙中WRKY基因的筛选与鉴定

甜橙和枳橙的WRKY蛋白序列分别从柑橘泛基因组育种数据库 (Citrus Pan-genome to Breeding Database, Citrus Pan-genome2breeding Database) 获取。WRKY结构域（PF03106）的隐马尔可夫模型（HMM）从Pfam蛋白家族数据库 (Pfam is now hosted by InterPro) 下载，并通过HMMER搜索程序 (HMMER, Version 3.0) 以小于1e−5的E值识别潜在WRKY蛋白。所有非冗余蛋白序列被选择为潜在的WRKY蛋白，并通过SMART软件程序 (SMART: Main page) 和CDD软件程序 (NCBI Conserved Domain Search) 确认完整WRKY结构域的存在。没有保守WRKY结构域的基因被排除，仅保留最长的转录本。两种品种的WRKY蛋白的相对分子量（MW）和等电点（pI）通过ExPASy工具 (Expasy - Compute pI/Mw tool) 计算。

系统发育分析、基因结构和基序分析

通过ClustalW (Multiple Sequence Alignment - CLUSTALW) 对每种植物的WRKY蛋白进行多序列比对。基于氨基酸序列的系统发育分析采用邻接法（Neighbor-Joining）在MEGA软件 (Home, Version 11.0) 中单独进行，对甜橙、枳橙和拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 三个物种分别构建系统树，使用最大似然法（bootstrap值为1000次重复） [30]。拟南芥WRKY蛋白序列从拟南芥信息资源数据库 (TAIR, TAIR - Arabidopsis) 获取。基因结构显示服务器 (GSDS, http://gsds.gao-lab.org/index.php, Version 2.0) 用于通过匹配WRKY基因的基因组序列和编码序列（CDS）绘制外显子-内含子结构 [31]。MEME程序 (MEME - Submission form, Version 5.4.1) 被用来预测不同WRKY蛋白中的保守基序 [32]。分析设置为：重复次数不限；最大基序数为10；基序最佳宽度不小于20。

染色体定位和基因重复分析

从柑橘泛基因组育种数据库获取了编码这些CsWRKY和PtrWRKY蛋白的基因在染色体上的精确位置信息。WRKY基因的染色体定位图通过MapInspect软件 (http://mapinspect.software.informer.com/) 生成。基因按照物理位置（bp）的升序，从短臂端到长臂端依次绘制到九条染色体上。为了检测片段重复和串联重复事件，分别将每个WRKY序列与甜橙和枳橙中的其他WRKY蛋白序列进行比对。使用BLASTp程序识别潜在的同源基因对（E值 < 1e−5，取前三个匹配结果），并以表格格式输出。随后，将生成的表格文件和甜橙或枳橙基因组的GFF文件输入MCScanX软件，按以下参数分析重复类型：匹配分数（>20）、间隙惩罚（-1）、匹配大小（5）、E值（1e−5）和最大间隙（25），并通过CIRCOS软件 (Introduction to Circos, Features and Uses // CIRCOS Circular Genome Data Visualization) 进行可视化 [33]。

DNA分离与CLas定量

从接种腋芽的甜橙和枳橙中采集年龄和位置相似的嫩叶。将每株植物的三片叶柄混合并磨成粉末。根据文献方法 [34] 使用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取DNA。使用NanoDrop 2000（NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA）测定DNA浓度，并调整为20 ng/µL。每种样品随机采集三个生物重复。

使用CLas 16S F/CLas 16S R引物通过PCR检测分离的DNA样品中是否存在CLas病原体，并根据文献方法 [35] 通过定量PCR（qPCR）确定CLas感染程度。通过qCLas 16S F/qCLas 16S R引物扩增CLas 16S基因，使用qCt 18S F/qCt 18S R引物检测柑橘18S基因作为内参（附表S1）。每个样品进行三个生物重复和三个技术重复。根据CLas 16S基因的Ct值，Ct < 31.3的样品判定为CLas阳性，Ct > 36的样品为CLas阴性。CLas细菌种群（每微克柑橘DNA的CLas细胞数）通过文献公式 [36] 计算。选择CLas细菌种群相似的样品用于后续基因表达分析。

RNA提取与实时定量PCR（qRT-PCR）分析

按照RNeasy® Plant Mini kit（Qiagen, Germany）的说明从叶片中提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000检测RNA的质量和完整性。使用PrimeScript™ RT reagent Kit（含gDNA清除剂，Takara, Japan）合成cDNA。WRKY特异性基因引物由Primer Premier 5.0软件设计（附表S1）。实时qRT-PCR分析使用SYBR GREEN PCR Master Mix（TaKaRa, Japan）在QuantStudio 5 Applied BioSystem（ThermoFisher Scientific, USA）上进行。Actin基因作为目标基因的内参基因，用于标准化相对表达水平。qRT-PCR反应重复三次生物重复和三次技术重复，使用2−ΔΔCt方法计算相对表达水平。通过TBtools软件（Version 1.098696） [37] 基于log2转化数据构建热图。如果WRKY基因的表达水平超过2倍或低于0.5倍，则认为该WRKY基因显著表达。qRT-PCR实验按照文献方法 [38] 进行。使用TBtools软件生成维恩图（Version 1.098696） [37]，展示甜橙和枳橙在两种处理（SA或CLas感染）下共有的差异表达基因数量。

推测的胁迫响应CsWRKYs和PtrWRKYs的启动子分析

通过柑橘泛基因组育种数据库的“Sequence Fetch”工具提取选定WRKY基因转录起始位点上游2.0 kb的启动子序列，用于进行启动子分析。利用两个植物顺式元件数据库PlantCARE (PlantCARE, a database of plant promoters and their cis-acting regulatory elements) 和New PLACE (https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace) 分析启动子中的胁迫响应元件 [39,40]。识别到的顺式元件通过TBtools (Version 1.098696) [37] 可视化。

亚细胞定位实验

将CsWRKY7、PtrWRKY39、CsWRKY33和PtrWRKY32的完整编码序列（不含终止密码子）分别克隆并插入到pBI121-EGFP载体的Xba I和Xma I限制位点下，由花椰菜花叶病毒35S (CaMV 35S) 启动子驱动表达。融合质粒和空载质粒随后转化至农杆菌（Agrobacterium tumefaciens, GV3101）中，并将农杆菌悬液与编码核标记基因VirD2NLS融合mCherry的质粒共同转化至烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中，通过农杆菌侵染法进行瞬时表达。在感染三天后，通过激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP8, 德国）观察绿色荧光（GFP）和红色荧光（mCherry）。烟草的转化和侵染实验根据文献方法 [41] 进行。

转录激活实验

将四个WRKY基因（CsWRKY7、PtrWRKY39、CsWRKY33和PtrWRKY32）的完整序列或三个截短片段（N、W和C）扩增，并插入pGBKT7载体的EcoR I和BamH I限制位点，生成16种构建体。重组质粒和阴性对照质粒（pGBKT7）按照制造商说明（Matchmaker® Gold酵母双杂交文库筛选系统，Takara）分别转化至Y2HGold酵母细胞中。用SD/-Trp培养基培养酵母转化子。酵母细胞的转录激活活性通过在30℃下培养3至5天后，在添加显色底物X-α-gal（Sigma-Aldrich, USA）的SD/-Trp或SD/-Trp/-His/-Ade培养基上监测。

结果

甜橙和枳橙中WRKY转录因子的鉴定

为了鉴定甜橙（C. sinensis）和枳橙（P. trifoliata）中的WRKY家族基因，利用Pfam数据库中的隐马尔可夫模型（HMM）和BLASTp搜索，通过WRKY结构域的共识序列比对参考基因组。在甜橙和枳橙的基因组组装中，分别鉴定出94个CsWRKYs和87个PtrWRKYs。去除冗余序列和仅含部分WRKY结构域的序列后，甜橙中鉴定出52个WRKY成员，枳橙中鉴定出51个WRKY成员。详细信息见补充表S2和S3，包括基因ID、染色体编号、链信息、染色体起止位置、外显子和内含子数量、开放阅读框（ORF）序列长度、氨基酸（aa）数量、相对分子量、等电点以及单个基因成员的分类。根据它们在九条染色体上的升序排列对WRKY基因进行命名。

在甜橙中，CsWRKY蛋白的长度范围为116（CsWRKY2）至724 aa（CsWRKY14），平均长度约为381 aa。CsWRKY蛋白的分子量在13.35 kDa（CsWRKY2）到78.03 kDa（CsWRKY14）之间。预测的等电点值从5.06（CsWRKY41）到9.83（CsWRKY37）不等。52个成员中，22个定位于正链，30个定位于负链（补充表S2）。

在枳橙中，PtrWRKY编码的肽链长度从162（PtrWRKY8/9）到1390 aa（PtrWRKY21），平均长度为428 aa。PtrWRKY肽链的分子量和等电点范围分别为18.22 kDa（PtrWRKY34）至159.05 kDa（PtrWRKY21）和4.94（PtrWRKY50）至9.80（PtrWRKY51）。51个成员中，26个定位于负链，25个定位于正链（补充表S3）。

多序列比对和系统发育分析

为了进一步分类WRKY蛋白，对其结构域序列进行了多序列比对，并基于甜橙（52个成员）和枳橙（51个成员）的WRKY序列构建了邻接法（NJ）系统发育树，参考模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana，72个成员）[42] 的WRKY序列。系统发育树中的不同组和亚组以不同颜色标注（图1）。

柑橘属植物（甜橙和枳橙）及拟南芥WRKY的系统发育分析通过MEGA软件采用邻接法（NJ）和1,000次自助法（bootstrap）构建系统发育树，分析甜橙（CsWRKYs, 红色）、枳橙（PtrWRKYs, 黄色）及拟南芥（AtWRKYs, 蓝色）的WRKY蛋白。WRKY蛋白被分为I组、II组和III组，其中包含八个亚组（Ia，Ib，IIa，IIb，IIc，IId，IIIa，IIIb）。

通常，WRKY蛋白根据WRKY结构域的数量及锌指基序的特性分为三组五个亚组。具有两个WRKY结构域的蛋白（N端的Group Ia和C端的Group Ib），以及带有C2H2型锌指基序的蛋白，归为I组；仅含一个WRKY结构域且具有C2H2型锌指基序的蛋白归为II组；而III组的蛋白仅含一个WRKY结构域，并具有C2H型锌指基序。WRKY结构域包含一个或两个高度保守的短肽序列WRKYGQK，这一序列被认为对识别和结合W-box元件至关重要。甜橙和枳橙WRKY结构域核心序列的多序列比对见补充图S1。分析显示，52个甜橙WRKY蛋白和51个枳橙WRKY蛋白中，WRKYGQK序列是主要变体。然而，在5个WRKY蛋白（CsWRKY2、CsWRKY13、PtrWRKY8、PtrWRKY9和PtrWRKY21）中发现了由氨基酸Q替换为K的变异，形成了突变序列WRKYGKK。有趣的是，这两个甜橙WRKY蛋白和三个枳橙WRKY蛋白携带该突变，且均属于Group Ib。

根据研究结果，甜橙WRKY蛋白家族中，Group Ia包含9个成员，Group Ib有15个成员；Group IIa有3个成员，Group IIb有8个，Group IIc有5个，Group IId有6个；Group IIIa有6个。而在枳橙中，Group Ia有9个成员，Group Ib有13个，Group IIa有3个，Group IIb有8个，Group IIc有5个，Group IId有7个，Group IIIa有6个成员。值得注意的是，在甜橙和枳橙中均未发现Group IIIb的成员（图2A）。甜橙和枳橙中WRKY基因的分布具有很高的相似性（图2B）。Group Ia、IIa、IIb、IIc和IIIa中WRKY成员的数量在甜橙和枳橙中完全相同，其分布也几乎一致：甜橙的Ia为17.3%，枳橙的Ia为17.4%；IIa分别为5.8%和5.9%；IIb为15.4%和15.7%；IIc为9.6%和9.8%；IIIa为11.5%和11.8%。

虽然柑橘属植物与拟南芥在大多数亚组的WRKY基因数量上存在差异，但这些作物间WRKY基因的分布模式仍然相似。

不同物种和WRKY基因组的分布 (A) 各亚组中WRKY基因的数量 甜橙（Citrus sinensis）、枳橙（Poncirus trifoliata）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）中每个亚组的WRKY基因成员数量。 (B) WRKY基因的百分比分布 甜橙、枳橙和拟南芥中WRKY基因成员的百分比分布。

WRKY基因的基因结构分析

基因结构的相似性和多样性在基因家族的进化中起重要作用，而内含子/外显子的位置通常在直系同源基因中高度保守。为了探究甜橙和枳橙WRKY基因的结构多样性，我们通过比较基因组序列和CDS序列，分析了内含子/外显子的分布。

在甜橙中，Group I基因具有2到6个外显子；在枳橙中，外显子数量为2到12个。两种柑橘品种的Group IIa基因均具有4或5个外显子。Group IIb基因的外显子数量也存在差异：甜橙为4到6个，枳橙为4到8个。在Group IIc基因中，大多数甜橙和枳橙基因均含有3个外显子，例外情况包括甜橙中的Cs5g30250.4 (CsWRKY20)含有2个外显子，枳橙中的Pt5g004720.1 (PtrWRKY37)含有4个外显子。

总体来看，两种柑橘品种的外显子数量（2到12个）和长度表现出显著的多样性。然而，在亚家族水平上，成员在外显子数量和长度方面表现出相似的基因结构。例如，甜橙和枳橙中Group IId和Group IIIa的所有成员均含有3个外显子（图3A-B）。

甜橙和枳橙中WRKY基因的基因结构与保守基序分析 (A) 系统发育关系 甜橙（C. sinensis）和枳橙（P. trifoliata）WRKY蛋白的系统发育树。 (B) 外显子/内含子结构 WRKY基因的外显子和内含子结构使用黄色框（外显子）和黑线（内含子）表示。深蓝色框表示上游和/或下游未翻译区域（UTR）。 (C) 保守基序的分布 通过MEME程序识别的WRKY蛋白中10个保守基序用不同颜色的块表示，块中央的数字（1–10）代表不同的基序。这些保守基序的序列见补充表S4。

保守基序分析

WRKY蛋白通常包含额外的保守基序，可能与WRKY蛋白功能的激活有关 [43]。除WRKY结构域外的其他基序可能具有未知的功能或结构作用。使用MEME程序分析甜橙和枳橙WRKY蛋白的结构多样性和功能预测，共识别了10个保守基序，长度从21到50个氨基酸不等（补充表S4）。其中，基序1和3被注释为WRKY结构域。在CsWRKYs和PtrWRKYs中，其余8个非冗余基序的功能大多尚未明确，仅有两个功能性基序被MEME程序识别，分别是bZIP基序（基序5）和植物锌簇域（基序8）。50个氨基酸的bZIP样基序主要分布在Group IIa和Group IIb中，而长度为24个氨基酸的植物锌簇域主要出现在Group IIc中。

除基序1和2存在于所有序列外，基序5和基序6在密切相关的Group IIa和Group IIb成员中共同存在；基序7和基序9特有于Group IIb成员；而基序3和基序10仅存在于Group Ia成员中。结果表明，这些保守基序可能在其各自的亚组中具有潜在功能（图3C）。

染色体定位与基因重复

在甜橙基因组中共鉴定出52个WRKY基因，其中41个基因可定位在染色体上，11个基因的确切位置无法确定，包括CsWRKY42到CsWRKY52（见正文详细列表）。如图4所示，甜橙WRKY基因分布在全部九条染色体上。染色体7上的基因最多（10个，占19.2%），其次是染色体2（7个，13.5%）、染色体6（6个，11.5%）、染色体4（5个，9.6%）、染色体5和染色体9（均为4个，7.7%）、染色体1（3个，5.8%）。染色体3和8各含有一个基因。

在枳橙中，染色体3上的PtrWRKY基因最多（11个，占21.6%），而染色体5、7和9上的基因最少（各3个，占5.9%）。染色体1上有9个基因（17.6%），染色体2和4各有8个基因（15.7%），染色体6上有5个基因（9.8%）。仅有一个基因（PtrWRKY51）无法定位到特定染色体上。值得注意的是，在枳橙染色体8上未检测到任何PtrWRKY基因（图4）。

甜橙和枳橙WRKY基因的染色体定位与共线性分析图示中，水平条表示染色体，染色体编号位于中间，基因ID显示在图外。灰线表示这两种植物基因组中的共线性区块，蓝线突出显示了共线WRKY基因对。串联重复基因用绿色块表示，位于重复片段区域的基因用红线标注。这些WRKY基因的精确位置详见补充表S2和S3。

基因重复在植物进化中扩展基因家族起着重要作用。为进一步研究柑橘属植物WRKY基因的进化，分析了段内和串联重复的基因组重复事件。在甜橙中，仅检测到一对串联重复基因Cs7g29570.1 (CsWRKY35)和Cs7g29580.1 (CsWRKY36)，位于染色体7上（图4中的绿色块表示）。此外，位于染色体重复片段区域的两个CsWRKY基因形成了两对段内重复（Cs6g10120.1/CsWRKY24和Cs7g29570.1/CsWRKY35，图4中的红线表示）。

在枳橙中也发现了类似结果，染色体4上的PtrWRKY36 (Pt4g019960.1)和PtrWRKY35 (Pt4g019950.1)构成了一对串联重复基因（图4中的绿色块）。此外，枳橙染色体重复片段区域的四个PtrWRKY基因形成了两对段内重复（PtrWRKY20 (Pt3g002870.1)和PtrWRKY26 (Pt3g037470.1)；PtrWRKY36 (Pt4g019960.1)和PtrWRKY42 (Pt6g011450.1)，图4中的红线表示）。

总体来看，在甜橙和枳橙中，串联和段内重复事件并不显著，这表明这些现象在CsWRKY和PtrWRKY基因的进化中作用有限。此外，分析了甜橙和枳橙之间的WRKY基因直系同源关系，确定了48对直系同源基因对（图4中的蓝线表示）。另有7个WRKY基因未找到直系同源基因，其中甜橙4个（Cs1g03100.1/CsWRKY1、Cs1g03870.1/CsWRKY2、Cs6g06940.1/CsWRKY22、CsUnPt004120.1/CsWRKY9），枳橙3个（Pt1g023510.4/PtrWRKY9、Pt3g023910.2/PtrWRKY21、Pt2g024060.1/PtrWRKY13）。值得注意的是，除枳橙的PtrWRKY13外，其余6个基因均属于Group Ib。

SA处理下WRKY基因的表达模式

为深入了解WRKY基因在植物抗病中的潜在功能，通过qRT-PCR分析了CsWRKYs和PtrWRKYs在SA处理下的表达模式。

在甜橙的52个WRKY基因中，17个基因（CsWRKY1, 3, 5, 9, 10, 12, 14, 15, 25, 26, 27, 36, 37, 38, 40, 43, 49）的转录本丰度未见显著变化，而其余35个CsWRKY基因在SA处理下的转录水平发生了变化。其中，31个基因（如CsWRKY2, 4, 6, 7, 8, 11, 13, 16, 17, 20, 21等）表达上调，4个基因（CsWRKY18, 19, 22, 45）表达下调（图5A，补充表S5）。

枳橙中的WRKY基因表现出与甜橙类似的表达模式。大多数PtrWRKY基因（如PtrWRKY1, 2, 3, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 17等）在SA处理下显著上调，仅有3个基因（PtrWRKY18, 19, 38）表达显著下调，其余10个基因的表达水平未见显著变化（图5B，补充表S5）。

甜橙（A）和枳橙（B）WRKY基因在SA处理下的表达谱表达分析在甜橙和枳橙叶片中于不同时间点（0小时、灌溉2 mM SA后3小时和6小时）进行。qPCR结果通过log2转化归一化，并使用TBtools软件构建热图。热图右侧垂直显示颜色标尺：较高表达水平以红色和较大的形状表示，较低表达水平以绿色和较小的形状表示。

WRKY基因在CLas感染下的表达谱

为了进一步研究WRKY基因在应对黄龙病（HLB）中的功能，分析了健康与CLas感染的甜橙和枳橙植株中WRKY基因的表达模式。在接种CLas三个月后，通过PCR检测发现，8株甜橙幼苗中有7株为阳性植株，而枳橙幼苗中仅有3株检测到CLas病原体（图6A-B，完整凝胶结果见补充图S2）。进一步的qPCR分析表明，阳性甜橙幼苗的CLas 16 S Ct值显著低于阳性枳橙幼苗的Ct值，同时接种的甜橙幼苗的CLas细菌群数量也明显高于枳橙（图6C-E）。这些结果验证了以往研究，表明枳橙相较于甜橙对黄龙病具有一定的耐受性。选取来自CLas接种的甜橙（CLas-2、4和5）和枳橙（CLas-2、3和6）的CLas细菌群数量相似的材料进行基因表达分析。

在甜橙中，大量WRKY基因（CsWRKY2, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 17, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 35, 36, 40, 44, 47, 50, 51, and 52）在CLas感染植株中的表达水平显著低于健康植株。八个CsWRKY基因（CsWRKY4, 16, 18, 19, 24, 32, 41, and 45）在CLas感染植株中显著上调，而15个CsWRKY基因（CsWRKY1, 3, 10, 11, 15, 31, 34, 37, 38, 39, 42, 43, 46, 48, and 49）在健康和CLas感染植株间未见表达水平变化（图6F，补充表S6）。

在枳橙中，20个PtrWRKY基因（PtrWRKY5, 8, 9, 16, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 34, 35, 37, 41, 44, 45, 48, and 51）对CLas感染无反应，15个基因（PtrWRKY3, 4, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 24, 32, 38, 39, 42, 43, and 50）在CLas感染后上调，16个基因（PtrWRKY1, 2, 6, 7, 10, 12, 14, 18, 20, 29, 33, 36, 40, 46, 47, and 49）下调（图6G，补充表S6）。

CLas 16S基因检测及CLas接种前后WRKY基因的表达谱 (A-B) CLas病原体的PCR检测结果 图A为甜橙幼苗接种后三个月的检测结果，图B为枳橙幼苗的检测结果。完整的凝胶图见补充图S2。 (C-D) 接种后三个月的平均Ct值 柱状图上方的不同字母表示根据Tukey检验（p < 0.05），CLas 16S基因的最高Ct值（#1为枳橙）与其他样本之间的显著差异。 (E) 接种后三个月的细菌数量（Log10 CLas cells µg⁻¹柑橘DNA） 柱状图上方的不同字母表示根据Tukey检验（p < 0.05），最高细菌数量（#6为甜橙）与其他样本之间的显著差异。 H代表健康植株，CLas代表CLas接种植株。 (F-G) 甜橙（F）和枳橙（G）WRKY基因的表达分析 接种后三个月对甜橙和枳橙叶片中的WRKY基因进行表达分析。qPCR结果通过log2转化归一化，使用TBtools软件构建热图。图右侧垂直显示颜色标尺：较高表达水平以红色和较大的形状表示，较低表达水平以绿色和较小的形状表示。

WRKY基因的差异表达分析

SA处理和CLas感染下WRKY基因的相似表达模式可能与SA依赖途径中对黄龙病（HLB）的响应相关。首先，使用维恩图揭示甜橙和枳橙中在两种处理下的共同表达变化。分别进行了以下六类分析：

SA↑（SA处理上调）、
SA↓（SA处理下调）、
SA（SA处理无显著变化）、
HLB↑（CLas感染上调）、
HLB↓（CLas感染下调）、
HLB（CLas感染无显著变化）。

甜橙（C. sinensis） 如图7A所示，在SA↑和HLB↑的共同比较中发现了5个上调的CsWRKY基因；而在SA↓和HLB↓的共同比较中仅检测到1个下调的CsWRKY基因。

枳橙（P. trifoliata） 如图7B所示，在SA↑和HLB↑的共同比较中发现了11个上调的PtrWRKY基因；在SA↓和HLB↓的共同比较中发现了1个下调的PtrWRKY基因。

进一步比对这些WRKY基因表明，CsWRKY4/PtrWRKY15、CsWRKY24/PtrWRKY42和CsWRKY32/PtrWRKY3这三对WRKY基因出现在SA↑和HLB↑的比较中，且为直系同源基因。这表明这些基因可能参与SA依赖的HLB抗性反应。

甜橙和枳橙WRKY基因在SA处理和/或黄龙病感染下的维恩图分析 (A) SA处理和黄龙病感染下甜橙WRKY基因的重叠分析 (B) SA处理和黄龙病感染下枳橙WRKY基因的重叠分析 (C) SA处理下甜橙和枳橙WRKY基因的重叠分析 (D) 黄龙病感染下甜橙和枳橙WRKY基因的重叠分析 不同颜色和线型的线条代表不同的类别：

Cs: 甜橙 (C. sinensis)
Ptr: 枳橙 (P. trifoliata)
SA↑: SA处理上调
SA↓: SA处理下调
SA: SA处理无显著变化
HLB↑: 黄龙病感染上调
HLB↓: 黄龙病感染下调
HLB: 黄龙病感染无显著变化

WRKY基因在不同品种中的相反表达模式 WRKY基因在不同品种中的相反表达模式可能与对黄龙病的耐受性差异有关。在SA处理或CLas感染下，分别分析了甜橙和枳橙中表现出相反表达模式的WRKY基因。

在SA处理下，未发现甜橙和枳橙中具有相反表达模式的共有WRKY基因（图7C）。
在黄龙病感染下，发现6对直系同源WRKY基因（CsWRKY6/PtrWRKY17、CsWRKY7/PtrWRKY39、CsWRKY23/PtrWRKY43、CsWRKY33/PtrWRKY32、CsWRKY47/PtrWRKY24和CsWRKY52/PtrWRKY11）在Cs HLB↓和Ptr HLB↑类别中重叠；1对直系同源基因（CsWRKY19/PtrWRKY18）在Cs HLB↑和Ptr HLB↓类别中重叠（图7D）。这些结果表明，CLas感染下相反表达的WRKY基因可能促成不同柑橘品种间黄龙病抗性的差异。

预测潜在胁迫响应的WRKY基因及其启动子分析

转录因子与启动子中胁迫诱导顺式元件的相互作用能够调控基因表达网络以应对物理、环境和生物胁迫 [44]。由于甜橙和枳橙中直系同源WRKY基因在CLas感染下表现出相反表达模式，推测这种变化可能与其上游调控因子相关。为验证该假设，分析了7对具有相反表达模式的直系同源WRKY基因的启动子（6对来自Cs HLB↓/Ptr HLB↑比较，1对来自Cs HLB↑/Ptr HLB↓比较）。

启动子区域分析 在这些候选WRKY基因的启动子区域（-2.0 kb）中，识别了胁迫响应顺式元件（图8，补充表S7）。

无显著差异的基因：如CsWRKY23/PtrWRKY43、CsWRKY47/PtrWRKY24、CsWRKY6/PtrWRKY17，其启动子的元件类型或数量无显著差异。
存在小差异的基因：如CsWRKY19的启动子中含有MYB-TF结合位点，而其直系同源基因PtrWRKY18没有。类似地，CsWRKY52的启动子中存在ABF-TF结合位点，但其直系同源基因PtrWRKY11中没有此类元件。
显著差异的基因：如CsWRKY7的启动子中含有5个MYC-TF结合位点，而其直系同源基因PtrWRKY39的启动子中未检测到任何MYC-TF结合位点。相反，PtrWRKY32的启动子中含有4个ABF-TF结合位点，而其直系同源基因CsWRKY33的启动子中未检测到ABF-TF结合位点。

这些差异可能解释了这些WRKY基因在CLas感染下的相反表达模式，并提示其潜在的调控机制。

候选WRKY基因启动子中的顺式元件分析在候选WRKY基因的上游2.0 kb启动子区域中，识别了与胁迫响应相关的顺式元件。不同颜色的矩形表示不同类型的顺式元件。这些元件的序列和位置的详细信息见补充表S7。

亚细胞定位和转录激活活性

典型的转录因子（TF）通常具有两个基本特性：定位于细胞核中，并具有转录激活活性。为了更深入的研究，我们克隆了两对直系同源WRKY基因（CsWRKY7/PtrWRKY39 和 CsWRKY33/PtrWRKY32），这些基因在CLas感染下表现出相反的表达模式，并且在启动子区域的顺式元件类型或数量上存在显著差异。

亚细胞定位分析 为了分析亚细胞定位，这些基因的全长cDNA被与绿色荧光蛋白（GFP）融合，置于CaMV 35S启动子驱动下进行表达。通过农杆菌介导的方法将融合基因转化至烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中。同时，共转化一个核标记基因（与mCherry融合）以确认核定位。对烟草表皮细胞的对照成像显示，绿色荧光分布于整个细胞，包括细胞膜、细胞质和细胞核。

进一步分析发现，四个WRKY蛋白（CsWRKY7、PtrWRKY39、CsWRKY33 和 PtrWRKY32）的绿色荧光信号仅分布于细胞核中（图9A）。

选定WRKY蛋白的亚细胞定位与转录激活活性分析 (A) 亚细胞定位分析 35S::GFP 和 35S::GFP-WRKY 质粒通过农杆菌介导瞬时转化至烟草 (Nicotiana benthamiana)叶片中，并通过共聚焦激光扫描显微镜观察。 (B) 四个WRKY蛋白的示意结构 根据氨基酸结构，四个WRKY蛋白被截短为N端（N）、W端（含保守WRKY结构域，W）和C端（C）（如图9B所示）。 (C) 转录激活活性分析

为了检测这四个核定位WRKY蛋白在基因表达调控中的转录激活活性，采用了酵母的GAL4响应报告系统。将WRKY蛋白的全长（FL）和三个截短片段（N, W, C）分别融合至pGBKT7载体以生成效应子。所有融合质粒分别转化至Y2HGold酵母菌株，并在缺乏色氨酸的SD培养基（SD/-Trp，SDO）上形成可见的白色菌落。

含有CsWRKY7、PtrWRKY39、CsWRKY33 和 PtrWRKY32全长片段的酵母转化子均可在缺乏色氨酸、腺嘌呤和组氨酸的SD培养基（SD/-Trp/-Ade/-His，TDO）上存活，并在添加X-α-gal的TDO培养基（TDO + X-α-gal）上显现蓝色。
在所有截短片段中，仅包含CsWRKY7-N、PtrWRKY39-N、CsWRKY33-C 和 PtrWRKY32-C的酵母细胞在添加X-α-gal的培养基上生长并显示GAL4活性（图9C）。

这些结果表明，这四个WRKY蛋白均具有转录激活活性，其中CsWRKY7和PtrWRKY39的N端显示较强的转录激活能力，而CsWRKY33和PtrWRKY32的转录激活依赖于其C端。

讨论

本研究对两种柑橘属植物中的WRKY家族进行了全面分析，包括其基因结构、蛋白基序、基因重复和共线性关系。此外，还进一步探讨了WRKY基因的表达模式和功能。

两种柑橘属植物中WRKY基因的全基因组探索与进化分析

通过BLASTp搜索和HMMER分析，在甜橙（C. sinensis）基因组中发现了52个WRKY蛋白，在枳橙（P. trifoliata）基因组中发现了51个WRKY蛋白。此前的研究通过在十个数据库中以“WRKY & Citrus”为关键词搜索，挖掘了甜橙中的50个非冗余WRKY基因 [45]。详细对比表明，这50个CsWRKY基因均包含在本研究中鉴定的WRKY基因中，并且本研究还发现了两个额外的CsWRKY基因（orange1.1t01175.1 和 orange1.1t02759.1），表明在构建隐马尔可夫模型后进行BLASTp搜索的方法能够更全面地识别潜在的WRKY基因。

在甜橙和枳橙中，大多数基因因其内含子-外显子结构的相似性而密切相关，这表明它们具有较近的系统发育关系。这种显著的内含子-外显子结构相似性也支持了共同祖先的概念 [46, 47]。此外，观察到在两个物种中，Group IIb中的WRKY基因内含子数量显著高于其他组，这一现象在拟南芥、芝麻、高粱和甜菜中也有类似报道 [20, 48, 49, 50]。最新研究表明，在水稻的片段重复后，内含子丢失的频率高于内含子增加的频率 [51]。这些结果暗示Group Ia亚组可能包含原始基因，其他簇可能由此衍生。此外，Group IIc中WRKY基因的内含子数量最少，表明柑橘中Group IIc基因可能处于进化的后期阶段。这一特性在藜麦和菘蓝中也有相似表现 [52, 53]。

保守基序分析

保守基序分析揭示了基因进化的一些有趣事实。Group I蛋白的基序4出现在含有WRKY结构域的基序1之前，同时在Group IIb蛋白中也发现了基序4（图3），表明Group IIb基因可能源自Group I基因的N端WRKY结构域的丢失。此外，Group Ib、Group IId和Group IIIa的系统发育亲缘关系及其保守基序表明它们来源于共同起源。值得注意的是，共线性分析显示甜橙和枳橙中的7个WRKY基因在两者之间没有直系同源基因，其中6个WRKY基因属于Group Ib（图4）。此外，5个携带突变WRKY结构域（WRKYGKK，Q氨基酸突变为K氨基酸）的WRKY蛋白也全部属于Group Ib（补充图S1）。结合共线性分析推测，柑橘中Group Ib的WRKY基因可能在进化中处于相对前期阶段，而其他亚组的成员可能未从该亚组中进化而来。

这些数据支持WRKY基因进化理论，即Group I是最古老的组，Group II和Group III由其演化而来。此外，本研究进一步表明，柑橘中的Group II和Group III成员可能来源于Group Ia。

单子叶与双子叶植物中WRKY基因的进化差异

关于拟南芥和水稻WRKY家族进化的研究表明，水稻中Group III的某些WRKY基因比拟南芥中的进化更活跃，表明Group III在单子叶植物中进化更活跃，并可能具有更多功能。这种单子叶和双子叶植物中WRKY基因分布的差异表明，Group III的成员在单子叶和双子叶植物分化后独立进化。值得一提的是，甜橙和枳橙中均未发现Group IIIb成员。基于C2H锌指基序的内部氨基酸之间的数量，Group III被分为两个亚组：Group IIIa（n≤23）和Group IIIb（n≥24）。因此，两种柑橘属植物中Group IIIb基因的缺失可能是由于这些基因在进化过程中氨基酸缩短所致，这也显示了WRKY结构域长度的多样性。

基因分布和重复事件分析

WRKY基因的分布表明，不同物种中WRKY基因的结构多样性差异明显。基因的不均匀分布是这些物种在分化后的进化过程中遗传变异的证据 [54]。最近的基因重复事件（包括片段重复和串联重复）被认为是基因家族扩展和进化的关键驱动力，也是新生物功能的原材料。在被子植物中，由于其对各种生理过程的显著贡献，WRKY家族可能在进化过程中迅速扩展。许多作物（如水稻和拟南芥）的WRKY基因扩展被认为与最近的基因重复事件有关 [42]。

然而，在某些情况下，最近的重复事件似乎对WRKY基因的扩展作用有限 [55, 56]。在本研究中，甜橙和枳橙中检测到的串联和片段重复基因数量较少，未如水稻和拟南芥那样显著。值得注意的是，在两种柑橘属植物的基因组中，所有串联重复基因对均属于Group IIIa，这与拟南芥的研究一致 [42]。研究表明，Group III的串联重复事件是柑橘属植物WRKY基因家族快速扩展的主要驱动力。

WRKY基因的表达与启动子分析为CLas感染下的功能研究提供了重要线索

先前研究表明，WRKY基因在植物的病原机制中具有重要作用。水杨酸（SA）是植物对病原体免疫反应中的关键激素。已有研究报道，多个WRKY基因能够被SA诱导并在植物抗病中发挥重要作用。例如，CaWRKY6通过转录激活CaWRKY40，正向调控辣椒对Ralstonia solanacearum的抗性 [24]；VqWRKY31被证实可抵抗葡萄中白粉病菌的侵染 [57]。这些基因的抗病机制均与SA信号通路有关。

在本研究中，对甜橙和枳橙WRKY基因家族的表达模式分析表明，大多数基因在SA处理和CLas感染下呈现不同的上调或下调模式。一些基因表现出显著的诱导，例如CsWRKY24在SA处理后3小时和6小时的表达水平分别达到259.17倍和92.20倍（图5，补充表S5）；CsWRKY4和PtrWRKY43在感染CLas后，表达水平分别提高了17.99倍和48.56倍（图6，补充表S6）。这些结果表明，某些WRKY基因可被SA处理或CLas感染显著诱导。

进一步研究发现，许多在CLas感染后显著表达的WRKY基因与SA处理下表达显著的基因具有高度重叠。相关研究表明，这些WRKY基因的同源基因在SA介导的植物抗病性中发挥作用。例如：

AtWRKY6（CsWRKY4/PtrWRKY15的同源基因）能够正向调控PR1启动子的活性，可能通过上调NPR1的转录水平来实现 [58]。
AtWRKY70（CsWRKY24/PtrWRKY42的同源基因）在植物对病原菌反应中整合了SA和JA信号通路的事件。WRKY70的功能获得或丧失会导致对A. brassicicola的JA介导抗性和对E. cichoracearum的SA介导抗性产生相反的影响，表明其在平衡SA和JA依赖的抗病通路中起重要作用 [59]。

鉴于不同植物中直系同源基因通常保留相似功能并共享关键特性，我们推测这些柑橘中的同源WRKY基因也可能在SA诱导的抗黄龙病（HLB）通路中起关键作用。

值得注意的是，甜橙和枳橙WRKY基因中的最后一对同源基因AtWRKY11被发现是对Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst)基础抗性的负调控因子。AtWRKY11功能丧失增强了对avirulent和virulent Pst菌株的抗性 [60]。此外，另一项研究表明，AtWRKY11和AtWRKY70是由Bacillus cereus AR156诱导的系统抗性（ISR）的重要调控因子。在ISR中，AR156处理显著诱导AtWRKY70转录，但抑制AtWRKY11，表明它们分别通过激活JA和SA信号通路调控ISR [61]。这些研究表明，WRKY基因在抗病信号通路中涉及多种调控机制。

病害耐受与易感品种WRKY基因在SA信号与黄龙病响应中的差异

为分析甜橙和枳橙中WRKY基因在两种处理后表达模式的差异，我们筛选出7对在两种处理下表现相反表达模式的同源WRKY基因（图7C-D）。这些基因可能是不同柑橘品种对黄龙病易感性差异的关键因素。

启动子区域的顺式元件是控制广泛基因调控网络的重要分子开关 [62]。对这7对同源WRKY基因的分析揭示，其中两对基因（CsWRKY7/PtrWRKY39和CsWRKY33/PtrWRKY32）在顺式元件类型或数量上存在显著差异。

AtWRKY33（CsWRKY7/PtrWRKY39的同源基因）参与SA信号通路并在抗Botrytis cinerea中发挥负调控作用，同时在wrky33突变体中伴随SA调控PR-1基因表达增加和JA调控PDF1.2基因表达降低 [63]。
WRKY45（CsWRKY33/PtrWRKY32的同源基因）是水稻中SA信号通路的重要转录因子，介导多种病原体的化学诱导抗性 [64]。研究表明，在感染Magnaporthe oryzae后，IPA1转录因子在DNA结合域内Ser163位点发生磷酸化，改变了其DNA结合特异性，进而激活WRKY45的表达并增强病害抗性 [65]。

这些研究表明WRKY基因（如WRKY45）的抗病性可能与其启动子活性及上游调控因子密切相关。综上所述，CsWRKY7/PtrWRKY39和CsWRKY33/PtrWRKY32两对同源WRKY基因的相反表达模式可能与其在病害耐受与易感柑橘品种中的上游调控因子有关。

候选WRKY基因是典型的转录因子（TFs）

大量研究表明，转录因子的功能与其定位密切相关 [66]。本研究中筛选的两对同源WRKY基因（CsWRKY7、PtrWRKY39、CsWRKY33和PtrWRKY32）均定位于细胞核中（图9A）。转录激活分析表明，这四种WRKY蛋白在酵母细胞中均表现出转录活性（图9C），说明它们是具有转录激活调控能力的典型转录因子，在细胞核中发挥功能，这暗示其功能可能与直接调控下游靶基因有关。然而，尚需深入研究以阐明其在SA信号通路和CLas感染中的上游调控因子及潜在下游靶基因。

本研究为柑橘WRKY基因的功能提供了全面信息，对黄龙病抗性基因的鉴定以及SA信号通路调控的分子机制和调控网络的研究具有重要意义。

结论

在两种柑橘属植物（甜橙和枳橙）中分别鉴定并分析了52个和51个WRKY基因。qRT-PCR和启动子分析表明，两对候选同源WRKY基因在两种柑橘物种中表现出相反的表达模式，且这些基因可能参与黄龙病响应及SA信号通路。实验结果表明，这些WRKY基因（CsWRKY7/PtrWRKY39 和 CsWRKY33/PtrWRKY32）是定位于细胞核的经典WRKY转录因子，具有转录调控功能。