俗称“万金油”的扩增子技术已经再难发出好文章了？实则不然!关联高端霸气上档次的单细胞转录组技术，扩增子研究依旧可以焕发新生机，重回高大上。
近日，檀国大学在《communications biology》上最新发表的文章打破了传统微生物组分析的界限，利用16s扩增子和单细胞转录组测序技术，在获取肠道微生物群落结构的同时，从单细胞层面挖掘了UC病患的异质性和复杂性，为UC宿主细胞与肠道微生物之间的复杂互作研究提供了新视角。
发表期刊：communications biology
影响因子：5.2
研究对象：小鼠肠道组织
发表时间：2024年6月
实验设计
本研究分别构建了急性结肠炎（AC）和慢性结肠炎（CC）小鼠模型，具体构建过程如下：
图 小鼠模型构建过程
图 研究思路
实验结果
1、UC会导致结肠中上皮屏障被破坏
与对照小鼠相比，患病小鼠的结肠的上皮细胞受到破坏（图1 a-d）。单细胞转录组测序分析识别了7个不同的细胞簇（图1 e）。AC中上皮细胞数量显著减少，在CC中有部分恢复，并且AC中上皮细胞屏障相关基因的表达显著下降，在CC中同样有所回升（图1 f-g）。
图1 UC样本上皮细胞的单细胞转录组测序分析
2、UC会导致细胞间相互作用发生改变
健康对照（HC）小鼠细胞间的相互作用相对平衡，AC中成纤维细胞和上皮细胞之间的相互作用明显减少，免疫细胞之间的相互作用增加，特别是巨噬细胞的趋化因子与 B 细胞、T细胞和成纤维细胞中的趋化因子受体之间的相互作用显著增加（图2 a-c）。CC中巨噬细胞和上皮细胞之间的相互作用增多，并且上皮细胞和成纤维细胞之间的相互作用恢复（图2 a、d）。
图2 UC样本中的细胞间相互作用
3、不同程度UC样本的炎症巨噬细胞群体变化
通过巨噬细胞的单细胞转录组分析结果可知， AC中巨噬细胞的趋化因子和细胞因子表现出增加的趋势，但增加程度略低于CC（图3 a-c）。与HC相比，AC和CC中的Il1b基因和IL-1β蛋白均上调（图3 d-e）。对巨噬细胞中的差异基因进行了GO分析，结果显示UC样本中炎症相关靶点增加（图3 f）。
图3 结肠的髓系细胞亚群分析
4、eNAMPT与NOX2过表达会加剧结肠炎病情
对可在调节炎症反应中发挥潜在作用的eNAMPT与NOX2复合体进行了深入研究（图4 a）。eNampt的表达在AC和CC中均表现出增加，Western blot分析证实了患病小鼠的巨噬细胞和结肠组织裂解物中UC相关蛋白表达均升高（图4 b-d）。并且CC中与炎症激活相关的基因表达水平显著增加。
图4 eNAMPT与NOX2复合体在UC样本中的关联作用
5、UC会导致肠道微生物群出现变化
通过16s扩增子测序分析肠道的微生物组成。与HC相比，CC中的肠道微生物多样性的普遍降低（图5 a-d）。HC的优势菌群是乳酸杆菌科，但在AC中该科显著减少。通过PICRUSt2对微生物功能进行分析，结果显示CC中的菌群失调会诱导许多炎症相关的代谢途径（图5 e-g）。
图5 UC样本的微生物群落分析
6、T细胞分化与结肠炎的患病程度有关
对UC状态下T细胞亚群的进行了UMAP聚类分析，在CC中观察到了差异极化的CD4 + T细胞（图6 a）。将患病小鼠与人类的 CD4 + T细胞亚群比例进行比较，可以在人类的患病样本中观察到类似的趋势（图6 b-c）。此外，Treg和Th17之间的不平衡会加速慢性UC的进展 (图6 d-e)。
图6 UC样本的T细胞亚群分析
研究结论
本研究将16s扩增子和单细胞转录组测序技术相结合，深入分析了UC致病的分子机制，揭示了在UC发展过程中关键的分子和细胞变化，为相关疾病的治疗策略开发提供了潜在方向。
本研究打破了微生态研究的传统限制，与单细胞转录组进行跨界组合，让微生物不再拘泥于与基因（转录组）、表型（代谢组）等进行联系，还能与宿主细胞建立关联，从而完成“肠道微生物-宿主疾病”模型的构建。
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参考文献
Hong, D., Kim, H.K., Yang, W. et al. Integrative analysis of single-cell RNA-seq and gut microbiome metabarcoding data elucidates macrophage dysfunction in mice with DSS-induced ulcerative colitis. Commun Biol 7, 731 (2024).
