实时荧光定量PCR技术(Realtime quantitative PCR，qPCR)是在PCR反应体系中添加荧光报告基团和荧光淬灭基团，通过荧光信号来实现对核酸分子的定量检测过程在反应过程中，PCR产物随着扩增反应的进行不断生成，荧光信号不断增加，进而可以通过荧光信号的变化对整个PCR过程进行实时监测，并通过标准曲线对原始板进行定量分析。
本文将从实时荧光定量PCR的反应阶段、常用参数、定量分析原理、常见分类、不同方法的优劣势等五个方面进行详细介绍。

1.反应阶段

实时荧光定量PCR的整个反应过程可分为基线期、指数期和平台期3个阶段：

• 基线期：PCR反应刚开始，受背景信号的影响，荧光信号无明显变化，无法判断产物量的变化；
• 指数期：随着循环数不断增加，PCR产物量的指数与DNA模板数呈线性关系；
• 平台期：随着DNA聚合酶、dNTP和引物探针消耗殆尽，扩增信号达到稳定，不再增加，反应到达平台期。

实时荧光定量PCR的三个阶段

2.常用参数

为了便于定量分析，在qPCR反应中引入了荧光阈值和循环阈值（Cyclethreshold, Ct）两个概念：

• 荧光阈值：是人为在荧光扩增曲线上设定的一个值。
• Ct：是指在PCR反应过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定阈值所经历的循环次数

3.定量分析原理

在反应体系中，若设计一定的荧光阈值，起始模板量越大，其达到荧光阈值所需的循环数越小，则Ct值越小。

在实验过程中，利用已知起始拷贝数的标准样品绘制标准曲线，由于待测样本PCR扩增产物数量与荧光基团发出的荧光强度呈对应关系，只要通过qPCR得到待测样本的Ct值，即可通过标准曲线计算待测样本的起始拷贝量。

4.常见分类

目前，根据所用荧光物质的化学原理和PCR检测的特异性，可将qPCR其分为两大类：

第一类：DNA染料法

荧光染料可以快速渗入DNA双链与之结合，发射荧光信号，而不掺入双链的荧光染料分子不会发射任何荧光信号，可以对特异性和非特异性的PCR扩增产物进行检测，例如SYBR Green I和 Eva Green。

DNA染料法

 

第二类：荧光探针法

可分为Taqman探针法和分子信标探针法

Taqman探针法是在PCR扩增时在加入一对引物的同时，再加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

当探针完整时，报告基团发出的荧光信号正好被淬灭基团吸收，体系中没有光信号;随着反应的进行，探针被Taq酶的5'-3外切酶酶切降解，使报告基团与淬灭基团分离，信号检测系统接收荧光信号。

分子信标是种由于碱基互补形成的茎环结构的寡核苷酸，由于荧光基团与猝灭基团靠得很近，荧光被淬灭。
PCR扩增过程中随着DNA双链解链，信标的茎环与暴露的DNA靶序列杂交，互补区被拉开致使荧光基团和泮灭基团之间距离增加，荧光恢复。 

 

 分子信标工作原理

5.三种qPCR方法的优劣势

1.DNA染料法可检测所有双链DNA扩增产物，包括非特异反应产物，如引物二聚
体，不需要探针，因此减少了实验设计及运转成本，适合于大量基因的分析，
简单易用；缺点是易产生假阳性现象。
2.Taqman探针法对于不同的靶序列需要合成不同的探针，原料成本较高，仅检测
特异性扩增产物，特异性优于DNA染料法，更适用于病原体检测。
3.分子信标法具有高灵敏、高特异、操作简便、灵敏度高、特异性强、还可用于
活体分析等特点，但合成探针成本较昂贵。