9+单细胞+实验验证，探讨单基因对癌细胞转移作用的思路方向

今天给同学们分享一篇单细胞+实验的生信文章“Identification of RAC1 in promoting brain metastasis of lung adenocarcinoma using single-cell transcriptome sequencing”，这篇文章于2023年5月18日发表在Cell Death Dis期刊上，影响因子为9。

本研究旨在为肺腺癌（LUAD）脑转移的生物标志物、相关途径和潜在疗法提供一个新的视角。作者利用 scRNA-seq 方法对一名 LUAD 患者的循环肿瘤细胞（CTCs）、原发肿瘤组织和转移肿瘤组织进行了全面的单细胞水平转录组分析，以确定与转移相关的生物标记物。

1. 单个患者样本数据分析显示，RAC1 在转移细胞中高度富集

作者首先对一名 LUAD 患者（患者 1）的 168 个单细胞进行测序，包括原发组织、CTC 和转移组织。根据管道中的标准进行过滤和修剪后，168 个样本中有 124 个通过了质量控制。

图1 研究设计概述

有趣的是，PC1/2 中的 CTCs 更接近转移瘤，而 PC1/3 中的 CTCs 更接近原发肿瘤。在 PC2/3 中，CTCs 也显示在转移组和原发组之间，这意味着癌症在转移过程中处于过渡或中间状态。尽管细胞之间存在异质性，但大多数样本都按其原发组织进行了分组，这可能是由于样本量较小的缘故。然后，作者根据差异表达基因分析了组织特异性标记物，并绘制了热图（图 1）。

图2 1 名 LUAD 患者的单细胞分析

作者推测，CTC 在原发期到转移期的过渡阶段起着过渡作用，在发病过程中促进转移的通路可能会增强。作者分析了明显增强的转移至 CTC 和 CTC 至原发的 DEGs，发现了一组持续上调的基因（表 S1）。LCN2、SAT1、RAC1、IFITM3、VAMP8、RAB13、NFKBIA 和 S100A4 等基因在 CTC 中升高，在 MTT 细胞中甚至更高。Violin 图显示了 "原发肿瘤组织（PTT）-CTC-MTT "中逐渐上调基因的表达谱（图 2c)。功能注释表明，这些转移相关基因组在调控细胞死亡和凋亡以及促进大分子组织方面发挥了关键作用（图 2d）。根据以往的文献，RAC1 对细胞运动具有不可分割的重要作用，有助于细胞的爬行、侵袭、增殖、抗凋亡等。

为了揭示EMT状态，作者使用EMT特征来量化每个癌症单细胞的上皮细胞和间质细胞得分。EMT特征热图显示了三种癌症群体的独特模式。MTT 中上皮信号比例较高，而 PTT 则显示出间质状态的倾向。CTCs的E+或M+得分较低，这可能是由于它们在血液中处于过渡状态。作者进一步扩大了数据集，使用所有 8 名患者的 452 个细胞（272 个来自转移癌细胞，180 个来自原发癌细胞）研究了上皮标记、间充质标记和 EMT 相关通路标志。结果显示，原发性癌细胞中间质标志物较多（如 NCAM1、LAMB1、SERPINE1、TCF4、VIM、ZEB1 和 ZEB2），而转移性癌细胞中上皮标志物较多（如 CDH1、CLDN4、ELF3、EPCAM、KRT18、KRT7 和 KRT8）。有趣的是，一些 EMT 通路信号分子在转移细胞中上调，包括 AKT1、MAPK1、MAPK3、RAS 基因（NRAS、KRAS 和 HRAS）、ROS1 和 PTK2。

2. 联合分析多个患者样本，探索 RAC1 相关基因和通路

为了验证转移相关分子，作者招募了另外7名患者，通过使用原发组织或转移组织进行单细胞测序。来自8名患者的单细胞的T-SNE图显示，细胞聚集成12个稳定的亚群，其中RAC1在转移性癌症细胞中高度表达（图3a）。绘制热图，每个亚组都显示出其独特的特征基因（图3b）。与原发性肿瘤和正常肺上皮簇相比，在转移亚组和CTC中发现RAC1和RAC1相关基因（包括RHOA、CDC42和VEGFB）的高表达（图3c）。共表达网络显示计算了与RAC1密切相关的基因，其中癌症基因如MUC1、MUC20、CEACAM5和CCL20与RAC1的表达呈正相关，而TIMP3和MGP与RAC1表达呈负相关（图3d）。火山图显示了RAC1高表达细胞和RAC1低表达细胞之间肿瘤细胞中不同表达的基因（图3e）。功能聚类和通路分析表明，RAC1高表达细胞中的基因在粘附、ECM和VEGF信号通路中发挥着关键作用（图3f）。

图3 8例LUAD患者的单细胞分析

为了证明LUAD的演变，作者绘制了一张基于Monocle 2的图表。实心黑线代表了构建的最小生成树的主要路径，它展示了LUAD沿着伪时间连续体发展的主干和顺序。轨迹清楚地表明，该树从8_Pulmonary_Epithelis开始，经过亚组6、11、3、2、7，并以5_LUAD_M_S100A8结束。基于伪时间连续谱，作者基于调节的内核进化富集基因功能注释确定了具有代表性的GOBP和KEGG集中项。

3. RAC1 是肿瘤转移的标志物，预后不良

作者还从公开的 RNA 和蛋白质数据集以及 LUAD 患者的 IHC 染色中获得了 RAC1 的病理证据。作者首先分析了 HPA 数据集中的 LUAD 患者图像。与正常组织相比，LUAD组织中RAC1的综合光学密度（IOD）水平明显升高（正常组织，n = 3；LUAD，n = 3；折叠变化 = 2.63；P < 0.01）（图4a、b）。来自 6 名原发性和转移性 LUAD 患者的其他组织样本被用于 RAC1 染色分析。IOD 结果显示 RAC1 在转移瘤中的高表达（正常组织，n = 6；LUAD，n = 6；折叠变化 = 3.83；P < 0.05）（图 4c，d）。通过使用 TCGA 数据集（Oncolnc 在线工具），作者分析了基于 RAC1 表达的 LUAD 患者生存情况。RAC1高表达的LUAD患者生存时间较短（红线），中位生存期为1081天，相比之下，RAC1低表达的患者生存期更长，为1798天（P = 0.0015）（图4a)。

图4 LUAD 患者的病理证据

4. 从多个角度看 RAC1 的表达水平会加速肺癌细胞的生长和转移

使用AnnexinV-PI和流式细胞术分析细胞凋亡（图5b、c）显示，RAC1抑制剂可显著促进两种LUAD细胞系的细胞凋亡（H1975的P < 0.001；A549的P < 0.001）。RAC1激动剂降低了细胞系中凋亡细胞的比例（H1975：P < 0.01；A549：P < 0.01）。在细胞周期方面，RAC1抑制剂阻碍了细胞从G0/G1期向S期的转变（G0/G1期增强，P < 0.001；S期抑制，P < 0.001），从而阻止了细胞分裂（图5d、e）。qPCR 和 WB 结果还显示，RAC1 抑制剂可降低细胞周期相关基因和蛋白（CDK4、CDK6、CyclinD1）的表达，而 RAC1 激动剂可促进细胞周期相关基因的表达（图 5f、g）。经 Transwell 试验验证，激活的 RAC1 功能可显著提高两种细胞系的侵袭能力（H1975：P < 0.01；A549：P < 0.05）（图 6a、b），而 RAC1 功能被破坏的细胞则表现为无活性（H1975：P < 0.05；A549：P < 0.05）。划痕伤口愈合试验表明，活化的 RAC1 能增强肺癌细胞在平板上的迁移能力（H1975：P < 0.01；A549：P < 0.05）。然而，在 RAC1 抑制剂存在的情况下，A549（P < 0.01）和 H1975（P < 0.001）的伤口愈合速度更慢（图 6c，d）。类胶体素染色结果表明，RAC1 抑制剂能显著抑制肺癌细胞中聚合肌动蛋白的表达（P < 0.01），而 RAC1 激动剂能显著促进肺癌细胞中聚合肌动蛋白的表达（P < 0.05，图 6c）。

图5 RAC1 可促进肿瘤细胞的增殖和细胞周期

图6 RAC1 促进了 LUAD 细胞的侵袭性和迁移能力

与空白组（无肿瘤负荷）相比，NC组和RAC1-OE组的MRI结果均显示有肿瘤负荷，RAC1-OE的原发灶性肿瘤在重量上明显重于NC组（P < 0.001，图7a，b）。qPCR结果显示RAC1过表达H1975细胞被成功构建（图7c）。作者仔细研究了RAC1-OE小鼠的不同断层图像，发现转移位点仅发生在大脑中，在其他器官（尤其是肝脏、骨骼或肾上腺）中未观察到转移。脑HE切片中有几个转移位点，其中最大的转移位点在右顶叶和侧脑室，这与MRI成像结果一致（图7d）。RAC1-OE组中RAC1、CDK4、CDK6和CyclinD1的表达显著增加（图7e）。