多肽合成的一般步骤 -- 固相合成篇

1.1 溶剂的处理 DMF、甲醇在使用前用G3孔的分子筛浸泡过夜除杂质和水。

1.2 树脂的充分溶胀称取2.0 g 空白Wang树脂于洁净干燥的反应管中，加入15 mL DMF，室温活化30 min左右。

1.3 接第一个氨基酸室温下，通过沙芯抽滤掉上步溶剂，加入1 mmol 5倍摩尔过量的 C端第一个氨基酸，5倍摩尔过量的DMAP，5倍摩尔过量的DIC，DMF做溶剂室温反应3 h。反应完毕用DMF洗4~6次，每次5-6 mL。再加入体积比为1:1的适量吡啶和乙酸酐，反应30 min。反应完毕用DMF洗4~6次，每次5-6 mL。（作用：封闭掉没有反应的空载树脂上的活性微点。）

1.4 Fmoc保护基的离去抽滤去掉上步溶剂，将10 mL 20%的哌啶DMF溶液加入到树脂中，N2搅拌10 min后滤出溶液，再加入10 mL 20%的哌啶DMF溶液，N2吹动搅拌5 min再滤去溶液，反复重复此操作两次后，用DMF洗4次，甲醇洗2次，每次5-6mL。

1.5 茚三酮检测脱除效果取出少量树脂，用甲醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃–110℃加热5 min，变深蓝色为阳性反应，说明脱除完全，即可进行下步反应；若呈无色，说明保护基没有脱除完全，则需要重复以上脱保护操作。

1.6 接第二个氨基酸及Fmoc保护基脱除称取3倍摩尔过量的C端第二个氨基酸，3倍摩尔过量的HBTU和3倍摩尔过量的HOBT于反应管中，加入适量DMF溶液使其完全溶解后，再加入10倍摩尔过量的（纯的）DIEA，室温反应40 min，用DMF洗4~6次，每次5-6mL。取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然后加入10 mL 20%的哌啶DMF溶液脱Fmoc，进行两次，分别为10min、5min，之后用DMF洗4次，甲醇洗2次，每次5-6mL。取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。

1.7 以此类推，重复2.6的步骤，直到合成到N端最后一个氨基酸，去掉Fmoc保护基，然后抽干。

1.8 树脂的脱落及纯品分离检测最后用三氟乙酸切割液（95% TFA：2%TIS：2%EDT：1% H2O）切割2 h，抽滤反应液，得多肽的三氟乙酸溶液，将裂解液用氮气尽量吹干，再用乙醚沉淀，离心，然后用乙醚洗3~5次，得白色固体，用纯水溶解后，经HPLC脱盐提纯，冻干后析出晶体，取少量MS分析。

【固相合成的优势】

操作简便和自动化：固相合成通常涉及重复的偶联步骤，这些步骤易于在固相上进行自动化处理，提高了合成效率和重现性。

较高的产品收率和纯度：由于固相合成中反应物被固定在固体载体上，可以通过简单的洗涤步骤去除未反应的试剂和副产物，从而获得较高纯度的目标分子。

易于放大合成规模：固相合成的放大效应较好，适合大规模生产，这对于工业应用尤为重要。

保护基选择多：固相合成允许使用多种保护基策略，这为合成复杂分子提供了更多的灵活性。

减少中间体提纯：在固相合成中，由于反应在固态进行，中间体无需提纯，节省了时间和劳动。

适用于自动化设备：固相合成的特性使其非常适合集成到自动化设备中，这对于现代药物合成和材料科学研究至关重要。

【固相合成在药物开发中的作用】

提高合成效率和纯度：固相合成允许反应在一个固定的位置进行，从而简化了分离和纯化步骤。这对于药物分子的合成尤为重要，因为它可以减少中间产物的损失和杂质的产生，确保最终产品的纯度和质量。

促进高通量合成：固相合成的操作简便性和高效率使得它适合于高通量合成，这对于快速筛选候选药物分子至关重要。通过并行处理多个合成反应，固相合成可以显著加快药物发现的速度。