J Transl Med结肠癌分子分型+简单实验

技术路线

实验设计（药物敏感性）

亮点

方法

从 TCGA 和 GEO 数据库下载大量和单细胞 RNA 测序以及 CRC 的临床数据。HRGs 和 LMRGs 来自分子特征数据库。使用 R 软件包 DESeq2 进行差异表达分析。使用无监督聚类进行分子亚型。使用单变量 Cox 回归、随机森林模型、LASSO 和多变量 Cox 回归分析开发预测特征。最后，使用体外实验验证了肿瘤细胞在缺氧前后对化疗药物的敏感性。

结果

我们将 575 例 CRC 患者分为 3 种分子亚型，并能够清楚地区分他们的预后。C1 亚型表现出高水平的缺氧，CD8 + T 细胞的比例较低，巨噬细胞的比例较高。免疫检查点基因的表达在严重免疫功能障碍的 C1 患者中普遍升高。随后，我们构建了一个预测模型 HLM 评分，可有效预测 CRC 患者的预后和免疫治疗的疗效。HLM 评分在 GSE39582 、 GSE106584 、 GSE17536 和 IMvigor210 数据集中进行了验证。HLM 评分高的患者在免疫微环境中表现出 CD8 + 耗竭 T 细胞（Tex）的高浸润，尤其是末端 Tex，和氧化磷酸化（OXPHOS）−Tex。最后，体外实验证实，在缺氧条件下，CRC 细胞系对 5-氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康的敏感性较低。

技术路线

本研究中执行的分析概述。CRC：结直肠癌;TCGA：癌症基因组图谱;K-M：卡普兰-迈尔;GSEA：基因集富集分析;CMS：共有分子亚型;KEGG：京都基因和基因组百科全书;GO：基因本体论;LASSO：最小绝对收缩和选择运算符;ROC：受试者工作特征;scRNA-seq、单细胞 RNA-seq

实验设计（药物敏感性）

在临床实践中，具有高危因素的 II 期 CRC 患者和 III 期和 IV 期 CRC 患者需要术后化疗。对常用化疗药物的敏感性极大地影响了 CRC 患者的结局和预后。因此，我们基于 GDSC2 和 CTRP2 数据库预测了三种亚型患者对最常用的 CRC 化疗药物（即 5-FU、奥沙利铂和伊立替康）的敏感性。在 GDSC2 数据库中，C1、C2 和 C3 亚型对 5-FU 的敏感性没有显著差异（p = 0.51，图 19 中的 3 个亚型对 5-FU 的敏感性。5然而，C1 亚型患者的半数最大抑制浓度（IC50）比亚型 C2 （p < 0.01）和 C3 （p < 0.01）中的水平高;在 C2 和 C3 亚型患者中，奥沙利铂敏感性未发现显著差异（p = 0.45，图 3）。5IC无显著差异50对于亚型 C1 和 C2 （p = 0.39）或 C3 （p = 0.22）之间的伊立替康。C3 亚型患者的 IC 略高50值比具有 C2 亚型（p < 0.01 的值，图 3 中的 1 个值。5当我们切换到 CTRP2 数据库时，我们发现 C1 亚型 5-FU 的 AUC 高于 C2 （p < 0.01）和 C3 （p < 0.01，图 1）。5G）亚型，表明 C1 亚型对 5-FU 最不敏感。此外，ssGSEA 发现 C1 中的干性富集评分更高（图 S2A），并且 LGR5 和 CD34 等干性相关基因在 C1 亚型中显著过表达于其他两种亚型（图 S2B、C）。干性特征的差异可能解释了亚组之间药物敏感性的差异。

为了更好地了解肿瘤细胞在低氧条件下对化疗药物的敏感性，我们在低氧（1% O2）和常氧（21% O2）条件。实验工作流程如图 1 所示。6个 A.表征 CRC 细胞系 HCT116 和 LS174T 对常规化疗药物 5-FU 、奥沙利铂和伊立替康的敏感性。此外，在缺氧和常氧条件下用或不用 HIF-1 抑制剂 BAY87-2243 处理细胞。台盼蓝染色显示，在相同浓度的 5-FU （7.5 μM）、奥沙利铂（7.5 μM）或伊立替康（HCT116 细胞中为 10 μM，LS174T 细胞中为 50 μM）的常氧条件下，缺氧 48 小时后肿瘤细胞的存活率更高（图 D）。6这些结果被 CCK8 实验证实（图 D）。6C-H）。值得注意的是，在低氧条件下，BAY87-2243 增加了 HCT116 和 LS174T 细胞对 5-FU 至常氧水平的敏感性（图 D）。6C， F）的然而，在常氧和缺氧条件下，BAY87-2243 降低了 HCT116 细胞对奥沙利铂的敏感性（图 D）。6D);在常氧条件下的 LS174T 细胞中也观察到了这一点（图 D）。6在缺氧条件下，BAY87-2243 增加了 HCT116 和 LS174T 细胞对伊立替康的敏感性（图 D）。6E， H）的

实验性工作流程。B 经受不同氧浓度和不同化疗药物治疗的细胞的台盼蓝染色。在 HCT116 细胞中，常氧或缺氧和 C 5-FU、D 奥沙利铂或 E 伊立替康治疗联合或不联合 BAY87-2243 后的 CCK8 实验。在 LS174T 细胞中，常氧或缺氧和 F 5-FU、G 奥沙利铂或 H 伊立替康治疗联合或不联合 BAY87-2243 后的 CCK8 实验。OXA：奥沙利铂;IRI：伊立替康;CCK8：细胞计数试剂盒-8;NS：没有意义。*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.001;P < 0.001