Advances in Flavonoid and Derivative Biosynthesis: Systematic Strategies for the Construction of Yeast Cell FactoriesCli

黄酮类化合物及其衍生物生物合成的进展：构建酵母细胞工厂的系统策略

摘要

黄酮类化合物是一类重要的天然多酚化合物，具有广泛的药理作用。 近年来，酵母细胞工厂（YCFs）的系统代谢工程取得了显著进展，为增强黄酮类化合物的生产提供了新的机遇。在本文中，我们概述了酵母细胞工厂中典型黄酮类产品的最新研究进展，并详细讨论了黄酮类化合物生物合成中的先进工程策略，包括前体供给的增强、辅因子工程、核心途径的优化、竞争性途径的消除、运输限制的缓解及动态调控。此外，我们重点指出了酵母中黄酮糖苷生物合成中存在的问题，例如黄酮糖苷的内源性降解、UDP-糖基转移酶的底物广谱性以及UDP-糖供给不足，并总结了相应的解决方案。文章还讨论了其他典型的后修饰，如异戊二烯化和甲基化，以及酵母中复杂黄酮类化合物的最新生物合成进展。最后，文章展望了一系列先进技术的应用，如半理性酶工程、机器学习/深度学习算法以及系统生物学，期望未来能够实现黄酮类化合物的大规模工业化生产。

1. 引言

黄酮类化合物是一类存在于天然药用植物中的多酚类次生代谢产物，具有由两个苯环（A 环和 C 环）通过三个中心碳原子（B 环）连接而成的 C6–C3–C6 骨架。目前，已鉴定出超过 15,000 种黄酮类化合物，使其成为最丰富且分布最广的生物活性植物天然产物之一。(1) 研究表明，黄酮类化合物具有多种生理功能，包括抗氧化、预防动脉粥样硬化、抗炎和抗癌等作用。(2-4) 此外，糖基化、甲基化和异戊二烯化等后修饰能够提高黄酮类化合物的生物利用度、溶解性和代谢稳定性。与生物结构-活性关系（SAR）一致，这些修饰扩展了黄酮类化合物在食品、制药和农业中的应用。作为一种具有经济价值的商品，黄酮类化合物的年全球市场价值已超过2亿美元。(5)

目前，黄酮类化合物及其衍生物主要通过植物提取和化学方法合成。(5) 虽然豆科植物和茶叶等植物是黄酮类的原始来源，但植物提取存在提取浓度低、提取过程复杂和生产周期长的局限性。(6) 化学合成虽然可以提高产量并生产纯化产品，但由于黄酮类化合物结构复杂且具有立体异构性，使得这种方法在合成生物活性化合物时面临挑战。鉴于合成生物学和系统工程的快速进展，利用微生物菌株生产黄酮类化合物成为了一种非常有前景的选择。该方法利用合成生物学策略有目的地调整代谢流和微生物细胞网络，以实现高产量，同时具有环保、低能耗及商业化生产的潜力。(7)

参与黄酮类合成的工程菌株，特别是酵母细胞工厂（YCFs），如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、油脂酵母（Yarrowia lipolytica）和毕赤酵母（Pichia pastoris, Komagataella phaffii），受到广泛关注。与大肠杆菌相比，这些酵母细胞能够进行黄酮类生物合成所需的翻译后修饰（PTM），特别是异源细胞色素P450（CYP450）家族酶，如肉桂酸羟化酶（C4H）和黄酮单加氧酶（FMO）。此外，酵母中代谢过程的分区化使得可以在过氧化物酶体和线粒体中进行代谢工程，从而提高乙酰辅酶A（acetyl-CoA）水平或重新配置碳代谢途径。这些酵母细胞还具有其他优点，包括：(1) 获得了“普遍认为安全”（GRAS）状态，为其在食品和营养品中的应用提供了安全保障；(2) 具有天然的莽草酸途径，可提供用于黄酮类生物合成的L-酪氨酸和L-苯丙氨酸；(3) 与高级基因操作工具兼容，如CRISPR/Cas9, (8) CRISPRi, (9) EasyCloneYALI, (10) YaliCMulti 和 YaliHMulti (11)，以实现精确的基因工程和途径组装。特别是作为克拉布特里阴性菌株，非模式微生物如Y. lipolytica 和P. pastoris 被高度认可，因为它们能够大量供应黄酮类合成所需的重要前体丙二酰辅酶A（malonyl-CoA），并对非常规碳源（如木质纤维素生物质、粗甘油）及挑战性条件（渗透胁迫、低pH 和有机溶剂）表现出耐受性。利用这些优势，Y. lipolytica 实现了黄酮类的前所未有的从头合成水平，如柚皮素达到8.3 g/L和鼠李素达到6.8 g/L。(11,12) 与此同时，工程化的P. pastoris 在生物反应器中柚皮素浓度达到1067 mg/L，创下了从甘油生产的最高报道产量。(13)

目前，通过整合异源基因，酵母中黄酮类合成途径已被广泛表征并进行了工程化。该途径大致可分为五个模块（图1）：(1) 芳香氨基酸（前体1）合成模块：该模块涉及L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的生物合成，它们是黄酮类合成的前体。这些氨基酸来自天然莽草酸途径，该途径将磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）转化为前苯酸（PPA），随后形成L-酪氨酸或L-苯丙氨酸。(2) 丙二酰辅酶A（前体2）合成模块：丙二酰辅酶A是黄酮类合成的另一种关键前体，由乙酰辅酶A经乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）催化生成。乙酰辅酶A可由多种途径获得，包括柠檬酸途径、丙酮酸脱氢酶（PDH）复合体途径、丙酮酸旁路途径和β-氧化。(3) (2S)-柚皮素合成模块：一分子对香豆酰辅酶A（由芳香氨基酸衍生）与三分子丙二酰辅酶A经查尔酮合酶（CHS）和查尔酮异构酶（CHI）催化的Claisen环化和脱水反应形成柚皮素，这是黄酮类合成的核心骨架化合物。(4) 柚皮素上游衍生模块：该模块涵盖从柚皮素上游前体合成的黄酮类化合物，如松柏素、黄芩素和异黄酮。(5) 柚皮素下游衍生模块：柚皮素经一系列酶促反应，如羟基化、氢化、重排和消除，生成下游的羟基化黄酮类，如黄酮醇、黄烷醇和花青素。通过阐明和工程化这些模块，可以定制酵母细胞中的黄酮类生物合成途径，从而实现具有潜在工业应用的多种黄酮类化合物的生产。

图1. 典型黄酮类产物的合成途径。

不同颜色表示不同类别：红色为黄烷酮类；黄色为黄酮类；紫色为黄酮醇类；橙色为黄烷醇类；绿色为异黄酮类；青色为花青素类。模块 I：芳香氨基酸合成模块；模块 II：丙二酰辅酶A合成模块；模块 III：(2S)-柚皮素合成模块，为核心黄酮类途径；模块 IV：柚皮素上游衍生模块；模块 V：柚皮素下游衍生模块。

缩写：PP途径：磷酸戊糖途径；DAG，二酰甘油；E4P，赤藓糖-4-磷酸；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；DHQ，3-脱氢奎那酸；CHA，莽草酸；PPA，前苯酸；L-Phe，L-苯丙氨酸；L-Tyr，L-酪氨酸；FFA，自由脂肪酸；PYR，丙酮酸；ARO1，5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶；ARO7，莽草酸变位酶；DGA1和DGA2，二酰甘油O-酰基转移酶；TGL，三酰甘油脂肪酶；PDC，苯丙酮酸脱羧酶；ALD，醛脱氢酶；ACS，乙酰辅酶A合成酶；ACC1，乙酰辅酶A羧化酶1；ACL，ATP-柠檬酸裂解酶；PDH复合体，丙酮酸脱氢酶复合体；PAL，苯丙氨酸解氨酶；C4H，肉桂酸羟化酶；TAL，酪氨酸解氨酶；4CL，4-香豆酰辅酶A连接酶；CHS，查尔酮合酶；CHI，查尔酮异构酶；CHR，查尔酮还原酶；FNS I，黄酮合酶I；F6H，黄酮-6-羟化酶；ATR2，细胞色素P450还原酶；2-HIS，2-羟基异黄烷酮合酶；HID，2-羟基异黄烷酮脱水酶；IFS，异黄酮合酶；F3′H，黄酮类-3′-羟化酶；CPR，细胞色素P450还原酶；F3H，黄烷酮-3-羟化酶；FLS，黄酮醇合酶；DFR，二氢黄酮醇4-还原酶；ANS，花青素合酶；FMO，黄酮类单加氧酶。

本综述全面概述了酵母细胞工厂在增强黄酮类及其衍生物合成方面的最新进展。 具体而言，综述深入探讨了旨在提高黄酮类生产的系统工程策略。我们还回顾了几种典型黄酮类产品的研究，总结了酵母细胞工厂中黄酮糖苷生物合成的挑战及相应策略，讨论了其他后修饰和复杂黄酮类衍生物的生物合成。最后，我们强调了该领域现存的挑战，同时探索了酶工程、机器学习和合成生物学在工业化规模上扩大黄酮类生产的机会。

2. 分类及典型黄酮类亚类产品

根据B环与C环的连接位置以及C环的饱和度（即2,3位是否存在双键），黄酮类可分为多个亚类。其中一些典型化合物具有广泛的应用前景，并且其生物合成引起了广泛关注（表1）。

subclass	typical product	engineered yeast	systematic engineering strategies	final yield and substrate	refs
Flavanone	Naringenin	S. cerevisiae	Enzyme screening: RsCHS and PsCHI; ratio of 4CL: CHS&CHI to be 3:4; dynamic control of p-coumaric acid and fatty acid; transporter engineering: PDR12↑	2.05 g/L; glucose	(63)
		S. cerevisiae	TYR1↑, PHA2↑, ARO1↑, ARO2↑, ARO3↑, ARO4**K229L↑, EcaroL↑, ARO8↑ ARO9Δ, PDC5Δ, ARO10Δ, Bbxfpk↑, Ckpta↑, GPP1Δ, replacing TSC13 with MdECR; ALD6↑, ACC1**S659A, S1157A, YlACL1↑, CIT2↑, YHM2↑, CTP1↑, Pc4CL-GGGS-AtC4H	3420.6 mg/L; glucose	(42)
		Y. lipolytica	Constructing YaliCMulti and YaliHMulti toolkits to achieve efficient long pathway integration in Y. lipolytica	8.3 g/L; glucose	(11)
		P. pastoris	ARO4**K229L↑, ARO7**G141S↑, EcAroL↑; fed-batch fermentation	1067 mg/L; glycerol	(13)
	Eriodictyol	S. cerevisiae	Promoter engineering; introducing ThF3′H; 2 copy number of ThF3′H; coculture of S. cerevisiae–E. coli	132.1 mg/L; glucose	(119)
		Y. lipolytica	YlAro1ΔIntro↑, YlAro2↑, ARO4**K221L↑, ARO7**G139S↑, POX1↑, FjTAL-At4CL-PhCHS-MsCHI↑; ZWF1-GND1-PYC↑	6.8 g/L; glucose	(12)
	Pinocembrin	S. cerevisiae	ARO4**K229L↑, ARO7**G141S↑, PHA2↑, ARO1↑, ARO2↑, ARO3↑, EcAroL↑, ACC1**S659A,S1157A↑, integrating RtmatC and RtmatB; enzyme screening: AtPAL and RsCHS; preventing CA degradation: FDC1Δand PAD1Δ; CNL:CHS:CHI = 3,4,4	80 mg/L; glucose	(15)
	Liquiritigenin	Y. lipolytica	Enzyme screening: ZmPAL, Pc4CL, PhCHS, MsCHR, MsCHI; protein fusion of CHS-CHR; promoter engineering to manipulate the liquiritigenin/naringenin ratio	62.4 mg/L; glucose and p-coumaric acid	(16)
Flavonol	Kaempferol, quercetin	S. cerevisiae	ARO4**K229L↑, ARO7**G141S↑, ARO1↑, ARO2↑, ARO3↑, EcaroL↑, ACC1**S659A, S1157A↑, AtFLS↑, 4CL:CHS:CHI = 3,4,4	956 mg/L, 930 mg/L; glucose	(23)
Flavanonol	Taxifolin	S. cerevisiae	ScAro4K229L, ScAro7G229S, At4CL1, PhCHS, MsCHI, AtF3′H/ATR1, ARO8↑, TYR1↑, BDH1**E221S/I222R/A223S↑	336.8 mg/L; glucose	(24)
	Taxifolin	Y. lipolytica	5 copy number of PhCHS and 2 copy number of CrCPR; YlAro1↑, YlACS2↑ and YlACC1↑	110.5 mg/L; glucose	(34)
Isoflavonoid	Genistein	S. cerevisiae	GmIFS, GmHID, AtCPR, STB5↑, YEF1↑, EcPntAB↑, ALD6↑, HEM2↑, HEM3↑, FAS1↓, PGM2↑, UGP1↑	23.3 mg/L; glucose	(26)
	Daidzein	S. cerevisiae	At4CL1, GmCHR5, GmCHS8, GmCHI1B2, CrCPR, Ge2-HIS, GmHID; 3 copy number of Ge2-HIS and GmHID, FAS1↓; cofactor engineering: HEM2↑, HEM3↑, Rox1Δ, HMX1Δ; protein fusion of AtC4H–At4CL1 and C4H-4CL	85.4 mg/L; glucose	(28)
Anthocyanidin	Delphinidin	S. cerevisiae–S. cerevisiae	ARO4**K229L↑, ARO7**G141S↑, ARO10Δ; replacing TSC13 by MdECR; integrating EcPDH and ScACC1; PDC1Δ, PDC5Δ, PDC6Δ; ERG9↓, ERG20↓; coculturing S. cerevisiae–S. cerevisiae	26.1 mg/L; 33.3 mg/L;31.7 mg/L; glucose	(29)
Pelargonidin
Cyanidin
Flavonoid glucoside	Scutellarein 7-O-glucoside	S. cerevisiae	EXG1Δ; PGM2↑, UGP1↑; increasing the content of glucose	1.2 g/L; glucose and scutellarein	(84)
	Pelargonidin 3-O-glucoside	S. cerevisiae	Enzyme screening: GhDFR; Pathway optimization: replacing TSC13 by MdECR; ARO3Δ, ARO4**G226S, PDC6Δ, PDC5Δ, ARO10Δ, AtPAL1↑, coC4H↑, AtCPR1↑, AtCHI1↑, AtCHS3↑, coCHS3↑, coTAL1↑, At4CL3↑, coF3H↑, coGhDFR↑, coANS↑, co3GT↑	0.01 μmol/gCDW; glucose	(31)
	Cyanidin-3-O-glucoside	S. cerevisiae	CsF3H-SmF3′H-SlF3′5′H-GmCPR↑, FaDFR-PhANS-Dc3GT↑, VvAro1↑, Sfc1↑, PEX10↑	33.4 mg/L; 12.3 mg/L; glucose	(30)
Delphinidin-3-O-glucoside
	Eriocitrin	S. cerevisiae	EXG1Δ, EGH1Δ, SPR1Δ, PGM2↑, GT from Arabidopsis thaliana; enzyme fusion of RHM-NRS; promoter engineering to balance the two-step glycosylation	131.3 mg/L; eriodictyol	(91)
	Scutellarin	Y. lipolytica	Enzyme screening: SbF6H-ATR2; pathway optimization: CHS↑, FNS I↑, SbF6H↑; cofactor engineering: ZWF1↑and GND1↑; enhancing oxygen supply: VHb↑	703.0 mg/L; glucose	(18)
	Baicalin	P. pastoris	A codon-optimized variant of SbUBGAT; enhancing the supply of UDP-sugar; constructing a P. pastoris–P. pastoris coculture system	1290.0 mg/L; glucose	(19)
Prenylated flavonoid	8-Prenylnaringenin	S. cerevisiae	Truncated HMG1; tHMG1↑; replacing TSC13 with MdECR; introducing TAL from R. capsulatus	0.12 mg/L; glucose	(98)
	8-Prenylnaringenin	S. cerevisiae	Screening and mutation to obtain tSfN8DT-1P229 and N305; strengthening the MVA pathway: tHMGR↑ and IDI1↑	49.4 mg/L; glucose	(99)
Methylated flavonoid	Oroxylin A	P. pastoris	Coexpressing PALs, SbCLL1, SbCHS2, SbCHI, SbFNSII1, SbF6H, and OMT5; using a series of ethanol-induced promoters to regulate oroxylin A synthetic pathways	339.5 mg/L; ethanol	(102)
	Sakuranetin	S. cerevisiae	At4CL1↑, PhCHS↑, MsCHI↑, OsNOMT↑, ACC1**S659, S1157A↑, ARO4**K222L↑, ARO7**G141S↑, ARO10Δ, PDC5Δ, ARO1↑, ARO2↑, PHA2↑, MtPDH1↑, EcaroL↑	158.7 mg/L; glucose	(104)
Polyhydroxylated flavonoid	Dihydromyricetin	S. cerevisiae	Precursor engineering: ARO4**K229L↑, ARO7**G141S↑; pathway optimization: GmCPR↑, SlF3′5′H↑; PDC5Δ, ARO10Δ	246.4 mg/L; glucose	(74)
Complex flavonoid	Icaritin	S. cerevisiae–E. coli	Locating GmOMT2 into the mitochondria/coculture of S. cerevisiae and E. coli	7.2 mg/L/19.7 mg/L; glucose	(108)
	Icariin	S. cerevisiae	Enzyme screening: LaPT2, MpOMT4, EkF3RT, Sb7GT; precursor engineering: ARO4**K229L↑, ARO7**G141S↑, ACC1↑, protein fusion of AtF3H-AtFLS, truncated LaPT2, tHMG1↑, IDI1↑, organelle engineering of LaPT2; dynamic regulation	130 μg/L; glucose	(109)

缩写： ↑, 上调表达；↓, 下调表达；Δ, 基因敲除。EXG1, EGH1, SPR1, 糖苷水解酶；CLL1, 4-香豆酸辅酶A连接酶样；STB5, 酵母本地转录因子；YEF1, ATP-NAD激酶；PntAB, 膜结合反氢酶；sfc1, 异柠檬酸/酮戊二酸载体蛋白。基因来源：At, 拟南芥；Ph, 矮牵牛；Cr, 长春花；Ms, 紫花苜蓿；Os, 水稻；Yl, 油脂酵母；Zm, 玉米；Pc, 香芹；Md, 苹果；Ec, 大肠杆菌；Sc, 酿酒酵母；Gm, 大豆；Sl, 番茄；Sm, 水飞蓟；Ge, 甘草；Rs, 映山红；Ps, 牡丹；La, 白羽扇豆；Mp, 薄荷；Ek, 朝鲜淫羊藿；Sb, 黄芩；co, 密码子优化版本；Gh, 大花秋葵；Th, 白鸢尾；Vv, 葡萄；Cs, 甜橙；Fa, 草莓；Dc, 康乃馨。

2.1. 黄烷酮类和黄酮类

黄烷酮类的特征是C环饱和，并且B环连接在2-碳位，包括(2S)-柚皮素、松柏素、(2S)-鼠李素和甘草素等化合物，这些化合物具有认知益处，可改善神经退行性疾病中的认知障碍。(14) 最近的酵母工程进展，尤其是在油脂酵母（Y. lipolytica）和酿酒酵母（S. cerevisiae）中，大大增强了黄烷酮的产量。在油脂酵母中，新的整合载体（YaliCMulti 和 YaliHMulti）促进了从头途径的整合，使柚皮素的产量达到8.3 g/L。(11) 类似地，在酿酒酵母中，通过优化前体供给、酶筛选和基因操作，松柏素的产量提高至80.0 mg/L。(15) 对油脂酵母的系统工程还实现了高产的鼠李素（6.8 g/L）(12) 和甘草素（62.4 mg/L）(16)，展示了酵母在黄烷酮合成中的潜力。

黄酮类与黄烷酮类的区别在于它们的C环具有不饱和双键，包括如黄芩素和黄芩苷等化合物。研究主要集中在生产它们的糖苷化衍生物黄芩素和黄芩苷，因其在治疗心血管疾病中的潜在疗效而受到关注。(17) 酵母种类如油脂酵母和毕赤酵母（P. pastoris）被用于高效生产黄酮类。在油脂酵母中，通过增强对香豆酸和NADPH水平、筛选最佳黄酮-6-羟化酶（F6H）、基因扩增CHS和黄酮合酶I（FNS I）、并增加UDP-葡萄糖和氧气供给的系统工程，使黄芩素的产量达到创纪录的703.0 mg/L。(18) 在毕赤酵母中，通过工程化糖基化途径和开发共培养系统，在放大生物反应器中实现了最高的新生黄芩苷产量（1290.0 mg/L）。(19) 这些进展突显了酵母平台在生产黄酮类及其衍生物中的多功能性，为新的工程途径提供了机会。

2.2. 黄酮醇类和黄烷醇类

黄酮类和黄烷酮类的3-羟基化形成黄酮醇类和黄烷醇类。槲皮素和山奈酚是主要的黄酮醇类产物，因其清除自由基、预防细胞损伤和抗炎作用而广泛应用。(20) 黄烷酮-3-羟化酶（F3H）和黄酮醇合酶（FLS）是将柚皮素转化为山奈酚的两种酶，而槲皮素则通过进一步的氢化反应由FMO催化生成。研究表明，FLS活性受限是导致中间产物二氢山奈酚积累的瓶颈，从而限制了山奈酚和槲皮素的产量。(21,22) 为缓解这一瓶颈，采用了酶筛选和基因扩增等策略。(23) 结合丙二酰辅酶A增强和补料分批发酵，山奈酚和槲皮素在酿酒酵母中的产量分别达到了956.0 mg/L和930.0 mg/L，创下了有史以来的最高水平。(23) 花旗松素是由柚皮素经F3′H/CPR和F3H催化生成的典型黄烷醇类化合物，其中F3′H属于CYP450酶家族，是限速酶。目前，通过工程化酿酒酵母，从葡萄糖生成花旗松素的最高产量为336.8 mg/L，采用了增强酪氨酸供给、筛选最佳F3′H/CPR组合和优化NADPH再生的策略。(24) 然而，产量仍然较低，需要进一步优化发酵过程和提高F3′H/CPR的催化活性。

2.3. 异黄酮类和花青素类

B环连接在C环的3位上形成异黄酮类。典型的异黄酮类如大豆苷元和染料木素具有温和的雌激素样性质和抗癌作用。(25) 最近在酿酒酵母工程中的进展实现了这些化合物显著的产量水平。例如，通过集成多个代谢途径和优化酶活性，染料木素的产量达到了23.3 mg/L (26)，而通过途径集成和辅因子调控结合，将大豆苷元的产量提高至85.4 mg/L，提升了94倍。(27) 这些发现强调了系统工程在提高生产产量方面的潜力，而进一步探索其他酵母细胞工厂在高产异黄酮生产中的能力仍然是未来研究的有前景方向。

花青素类，包括天竺葵素、翠雀素和矢车菊素，因其天然食品着色特性和抗氧化益处而受到重视。最近，在酿酒酵母中，通过共培养系统，天竺葵素、翠雀素和矢车菊素的产量分别达到了26.1 mg/L、33.3 mg/L和31.7 mg/L。(28) 通过增强前体途径和辅因子再生的进一步优化，糖基化花青素的产量增加，天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷分别达到了12.3 mg/L和33.4 mg/L。(29) 尽管存在途径酶二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）和花青素合酶（ANS）活性受限(30,31) 以及ANS底物广谱性等挑战(32)，这些进展突显了基于酵母的生产系统在生产异黄酮类和花青素类中的潜力，满足了功能性食品和营养补充剂的需求。

3. 酵母细胞工厂中黄酮类生物合成的系统工程策略

3.1. 增强芳香族氨基酸的供给

L-酪氨酸（L-tyr）和L-苯丙氨酸（L-phe）作为芳香族氨基酸（AAAs）分类，是黄酮类合成的关键前体（图2，部分A）。研究显示，在油脂酵母中补充100 mg/L的L-酪氨酸可使柚皮素的产量增加33.6%，表明黄酮类合成上游莽草酸途径存在瓶颈。(33)

图2. 通过前体工程策略增强酵母细胞工厂中黄酮类的生产。

(A) 增强芳香族氨基酸供给： (a) 通过酶突变去除负反馈抑制；(b) 强化莽草酸途径；(c) 平衡向PEP和E4P的代谢流。

(B) 通过突变或过表达相关基因来增强丙二酰辅酶A的含量。

(C) NADPH和血红素的辅因子工程： (a) 通过过表达参与磷酸戊糖途径和莽草酸途径的基因，或上调NADP+-依赖的三突变体BDH1E221S/I222R/A223S，增强NADPH供给；(b) 通过强化血红素合成途径或防止血红素降解，增加酵母中的细胞内血红素库。

缩写： DAHP, 3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸；EPSP, 5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸；HEM2, 5-氨基乙酰丙酸脱水酶；HEM3, 4-卟胆素脱氨酶；HEM13, 原卟啉原Ⅲ氧化酶；Rox1, 依赖血红素的缺氧基因抑制物。

在酵母细胞中，莽草酸途径中源于芳香族氨基酸的化合物的碳流主要受反馈抑制调控，(34) 这种反馈抑制限制了酶的活性和芳香族氨基酸的代谢流。在酿酒酵母中，这种抑制影响了两个关键反应：由Aro3和Aro4催化的PEP和E4P缩合生成DAHP（受L-苯丙氨酸和L-酪氨酸抑制），以及Aro7催化的莽草酸转化为前苯酸（受L-酪氨酸抑制）。(35) 缓解负反馈抑制的主要策略包括利用氨基酸不敏感的酶突变体，如Aro3K222L, (36) Aro4K229L, (37) Aro7G141S, (38) 和Aro7G139S。在这些策略中，单独过表达ARO4K229L或与ARO7G141S或ARO7G139S组合过表达均显著提高了柚皮素(28,39,40) 和鼠李素的产量。(12) 除了使用抗反馈酶，探索新途径以绕过受反馈抑制的步骤也是另一种策略，(34) 但其在提高酵母中黄酮类产量的应用尚待研究。

除了消除负反馈抑制，过表达本地途径酶和整合异源功能酶来增强莽草酸途径的流量，是增加L-苯丙氨酸和L-酪氨酸含量的另一策略。除了DAHP合成酶和莽草酸变位酶外，催化将DHQ转化为EPSP四个步骤的油脂酵母中的五功能AROM多肽YlARO1，是莽草酸途径中的另一限速酶。研究发现，其过表达显著提高了柚皮素、鼠李素和花旗松素的产量，分别增加了50.9%、38.8%和32.5%。(33) 此外，整合来自大肠杆菌的异源途径酶，如DAHP合成酶（AroGD146N和P150L）和莽草酸变位酶（TyrAM53I、A354R和EcaroL），也可有效提高酵母中黄酮类的产量。(18,41) 例如，共过表达ARO1、ARO2（莽草酸合酶）和ARO3并整合EcaroL，使柚皮素的产量增加了40.8%，从149.8 mg/L提高到210.9 mg/L。(41) 类似地，将AroGD146N、P150L与TyrAM53I、A354R整合至酿酒酵母Yl-scu20菌株的MHY1位点，显著提高了黄芩苷的产量，增幅达150.9%。(18)

此外，平衡来自糖酵解途径的PEP和来自磷酸戊糖途径（PPP）的E4P这两个莽草酸途径关键中间体之间的代谢流也非常重要，因为E4P的流量显著低于PEP，至少相差一个数量级。(42) 这种不平衡限制了来自莽草酸途径的芳香化合物的生产。为解决此问题，已在酵母中引入了异源磷酸酮糖酶-磷酸转乙酰化酶（PHK）途径以增强E4P的形成。在该途径中，磷酸酮糖酶将果糖-6-磷酸（F6P）转化为E4P和乙酰磷酸（AcP），随后磷酸转乙酰化酶将AcP转化为乙酰辅酶A。(43) 过表达来自短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）的磷酸酮糖酶BbFPK，使得E4P在酿酒酵母中的水平增加了5.4倍。(44) 然而，酵母中的内源磷酸酶如Gpp1和Gpp2可将AcP转化为乙酸，对细胞生长产生负面影响。(45) 为减轻这一问题，过表达另一种磷酸酮糖酶（BbXfpk）并敲除Gpp1，使对香豆酸的产量提高了40%。(46) 类似地，联合过表达Bbxfpk和Ckpta（来源于C. kluyveri的磷酸转乙酰化酶）并敲除Gpp1，使柚皮素在酿酒酵母中的产量增加了12.7%。(41)

3.2. 增加丙二酰辅酶A的含量

除芳香族氨基酸外，丙二酰辅酶A（图2，部分B）是黄酮类生物合成的另一关键前体，形成单一黄酮类结构需要三个丙二酰辅酶A单位。然而，酵母细胞内丙二酰辅酶A的供给通常不足，(47) 可能成为黄酮类生产的瓶颈。(48,49)

研究表明，突变的ACC1S659A,S1157A表现出更高的催化活性，(50) 并且其在酵母中的整合已导致松柏素(15) 和柚皮素(41) 产量增加。此外，确保充足的乙酰辅酶A供给（丙二酰辅酶A的重要前体）有助于补充丙二酰辅酶A并促进黄酮类合成。目前，已对乙酰辅酶A合成的四种途径（如前述引言中提及的）进行了初步探索，以提高黄酮类产量。例如，在酿酒酵母中引入异源ATP-柠檬酸裂解酶（MmACL），使(2S)-柚皮素的产量增加了9.6%；(41) 在酿酒酵母中引入大肠杆菌衍生的PDH途径基因并结合本地ACC1基因，显著提高了柚皮素的产量，从79.2 mg/L提高至126.0 mg/L；(28) 引入乙酰辅酶A合成酶的SeAcsL641P变体替代TAT1 (51) 并上调ALD6，使柚皮素在酿酒酵母中的产量提高了7.9%。(41) 除三种途径外，还探索了β-氧化相关的策略。这包括上调关键β-氧化相关基因，如编码酰基辅酶A氧化酶的基因，以及宿主生物固有的过氧化物酶体生物合成因子（PEX10和PEX11）。这些方法在酿酒酵母和油脂酵母中均显示出增强高水平黄酮类

生产的潜力。(12,52,53) 研究表明，过表达编码酰基辅酶A氧化酶1的基因（POX1）和ZmTyrc（来源于枯草菌的前苯酸脱氢酶Tyr1的突变体），使鼠李素产量增加了17.8%。(12) 此外，联合过表达PEX10和ARO4K229L使油脂酵母中柚皮素的产量提高了4倍，并具有克服在限定培养基中放大限制的优势。(52)

除了上述以乙酰辅酶A为中心的策略，将异源途径引入酵母为从替代底物生产丙二酰辅酶A开辟了新途径。其中一种方法是将丙二酸途径引入酿酒酵母，这一途径最近被探索用于提高黄酮类产量的有效性。(15) 具体来说，负责将丙二酸运输入细胞并将其转化为丙二酰辅酶A的基因RtmatC和RtmatB被引入平台菌株PIN16。向培养基中添加5.0 g/L二盐基丙二酸，使工程菌株PIN21中松柏素的产量显著提高，增幅为1.6倍。这一策略有望利用成本较低的底物来促进黄酮类或其他丙二酰辅酶A衍生化合物的生产。

3.3. NADPH和血红素的辅因子工程

辅因子工程（图2，部分C）旨在优化辅因子的可用性和利用率，以增强目标化合物的合成能力。(54,55) 该策略已显著提高了天然产物的产量，如咖啡酸（5.5 g/L）和阿魏酸（3.8 g/L）。(56) 在黄酮类化合物的生物合成中，NADPH是细胞代谢中的主要氧化还原辅因子，(57) 支持芳香族氨基酸生产的莽草酸途径，并作为CYP450酶和其他依赖NADPH的酶（如查尔酮还原酶CHR）的电子供体。因此，适当的NADPH水平对于酵母中黄酮类合成至关重要。

在酵母中，NADPH主要通过磷酸戊糖途径（PPP）生成，涉及关键酶如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（ZWF1）和6-磷酸葡萄糖脱氢酶（GND1），这些酶将葡萄糖-6-磷酸转化为核酮糖-5-磷酸，产生NADPH。其他来源包括：(1) 莽草酸途径，在该途径中，前苯酸在Tyr1的催化下转化为羟基苯丙酮酸（HPP），同时生成NADPH；(2) 在BDH1E221S/I222R/A223S三突变体的催化下，将乙偶姻转化为2,3-丁二醇的过程中也生成NADPH（图2，部分C）。(58) 多项研究证实了过表达PPP基因（ZWF1和GND1）、莽草酸途径基因（Tyr1和ARO8）、丙酮酸羧化酶编码基因（PYC）和BDH1E221S/I222R/A223S在增强酵母中黄酮类产量方面的有效性。(12,24,59) 例如，过表达莽草酸途径基因（Tyr1和ARO8）使酿酒酵母中花旗松素的产量提高了84.6%。类似地，过表达PPP基因（ZWF1和GND1）和丙酮酸羧化酶（PYC）使油脂酵母中鼠李素的产量增加了1.27倍。这些改进归因于NADPH水平的增强，有利于CYP450酶在黄酮类生物合成中的催化活性。

除了NADPH外，血红素是CYP450全酶组装的另一种氧化还原辅因子。研究表明，异源CYP450酶的过表达会因血红素耗竭而在微生物宿主细胞中引发应激反应，从而削弱整体酶活性。(60) 大豆苷元的生物合成涉及2-HIS催化，其作为限速酶催化B环的基团转位反应。(61) 为了增强2-HIS在大豆苷元生物合成中的催化活性，研究人员采用了一种专注于血红素调控的整体策略。(27) 该策略包括三种相互关联的战术：(1) 共调控血红素生物合成酶（HEM2和HEM3）以增强细胞内血红素库；(2) 删除Rox1（一种抑制HEM13表达的转录抑制因子）以促进血红素生物合成；(3) 去除血红素降解酶HMX1以保持血红素水平。其中，删除Rox1尤其有效，使酿酒酵母中大豆苷元的产量比亲本菌株增加了46%。通过增强细胞内血红素库，这些策略有望提高CYP450酶的整体功能，从而促进一系列由CYP450介导的黄酮类化合物（如鼠李素、花旗松素、槲皮素和染料木素）的生产。

3.4. 加强核心黄酮类途径

在代谢工程中，前体的可用性和下游途径容量之间的平衡对决定目标化合物的最终产量起着关键作用。尽管前体和辅因子的可用性足够，但下游途径流量的限制可能导致中间代谢物的积累，从而阻碍所需产物的高效合成。为解决这些挑战并实现高水平的黄酮类产量，研究人员采用了一种多方面的策略，重点优化了从芳香族氨基酸（AAAs）到柚皮素的下游途径（图1，模块III），该途径通常在黄酮类生物合成中被称为“核心黄酮类途径”。(12,15,62−64)

其中一项关键策略是将核心途径酶的多拷贝整合到如油脂酵母等微生物宿主中。该方法利用油脂酵母rDNA簇提供的随机多拷贝整合位点，促进异源途径基因的高效表达。例如，将核心黄酮类途径（RtTAL-Pc4CL-PhCHSx5-MsCHI）整合至26s rDNA位点，并结合使用Cre-loxP系统进行标记清除，显著提高了柚皮素、鼠李素和花旗松素的产量。(65) 不同于传统逐一细调特定途径基因表达水平的做法，一种称为组合转录优化的整体策略逐渐兴起。这种创新方法通过采用一系列不同强度的启动子，实现多个途径基因的同步调控。通过利用RNA-Seq数据，基于绿色荧光蛋白表达的差异性筛选出30个启动子，并将其整合至4CL-CHS-CHI途径中。通过结合高通量筛选方法和发酵优化技术，揭示了启动子的最佳组合。值得注意的是，这一整合方法在利用对香豆酸作为主要底物的5-L生物反应器系统中，使柚皮素的产量显著提高至1.2 g/L。(63) 该应用展示了系统性探索和利用生物合成途径调控图景在代谢工程中的潜力（图3，部分A）。

图3. 增强酵母中黄酮类生产的途径优化策略。

(A) 加强核心黄酮类途径： (a) 将途径基因整合至油脂酵母26s rDNA位点；(b) 核心黄酮类途径的组合转录优化。

(B) 筛选与空间调控关键途径酶： (a) 从不同物种筛选CYP450家族酶（CYP/CPR）；(b) 通过定向进化获得具有优异催化活性的蛋白突变体；(c) 使用蛋白融合策略，通过使用刚性蛋白连接体或柔性蛋白连接体来缩短两酶之间的距离。

(C) 消除竞争途径：主要采用的生物技术是RNAi和CRISPRi。

3.5. 筛选与空间调控关键途径酶

3.5.1. 酶筛选与修饰

在下游黄酮类的生物合成中（图1，模块V），羟化酶如F3′H、FMO和F6H属于CYP450家族，需要细胞色素P450还原酶（CPR）来激活其催化活性。(66) 然而，CPR酶活性的限制构成了阻碍氧化还原反应的瓶颈。(27) 酶工程通过理性设计和半理性设计可以显著提高特定酶的催化效率。(67) 但该方法依赖于已知的酶结构，而CPR的精确结构以及羟化酶与CPR的相互作用模型的缺乏，给实施理性修饰带来了挑战。(68) 为解决这些障碍，研究探索了非理性策略（图3，部分B）。其中一种方法是从不同物种中筛选具有更高活性的同工酶，以提高黄酮类产量。例如，组合来自大花秋葵的GhF3′H和来自长春花的CrCPR，可实现最高的鼠李素产量（39.0 mg/L），柚皮素转化率达到73.7%。(33) 这种不同酶之间的协同作用提高了催化活性，增强了生物合成途径的流量，并提高了目标黄酮类产物的产量。与基因筛选不同，定向进化为提高酶活性和底物特异性提供了一种有针对性的方法，这对于优化代谢途径和提高产物产量至关重要。在最近的一项研究中，通过基于误差-PCR的定向进化获得了突变体SmF3′HD285N/SmCPRI453 V。此突变使得酿酒酵母中鼠李素的产量从805.6 mg/L显著提高至1054.5 mg/L，展示了定向进化在微调酶活性以改善产物合成方面的有效性。(69)

3.5.2. 途径酶的空间调控

除了酶筛选和定向进化外，调控相互作用酶的空间距离也被证明能改善酶之间的相互作用并提高催化效率。(70) 蛋白融合可以通过使用刚性连接体（如VDEAAAKSGR）或柔性连接体（如GGGS）使两酶之间的距离更近。为了测试蛋白融合策略在黄酮类生物合成中的可行性，在酿酒酵母中评估了几种AtC4H-连接体-At4CL的融合组合。结果显示，AtC4H-GGGS-At4CL方向在菌株I02中实现了最高的甘草素产量（77.7 mg/L），增加了107%。(27) 类似地，另一项研究发现，VvLAR-(GGGGS)2-FaDFR组合使儿茶素（一种黄烷-3-醇）的产量提高了8.7倍，相较于未使用蛋白融合的菌株。(59) 鉴于C4H和4CL调控对香豆酸的水平，而LAR和DFR催化花青素的不稳定中间体白花青素的生成和稳定，这些发现表明蛋白融合作为一种策略，可以平衡黄酮类生物合成途径中间体水平，从而提高整体产物产量。

3.6. 消除竞争途径

副产物的形成会阻碍碳代谢流，从而影响高水平生产的实现。一般而言，三条竞争途径参与黄酮类合成：(1) 争夺对香豆酰辅酶A的苯丙酸途径；(2) 争夺乙酰辅酶A的脂质生物合成途径和乙醛酸循环（GYC）；(3) 与莽草酸途径竞争的苯乙醇途径（图3，部分C）。减少副产物形成或防止重要前体降解的主要策略是敲除或下调这些途径中的关键基因。在酿酒酵母中，内源性双键还原酶Tsc13将对香豆酰辅酶A转化为副产物苯丙酸。然而，由于其在脂肪酸合成中的关键作用，Tsc13无法完全删除。研究表明，用苹果的同源物MdECR替代Tsc13是一种有效策略，成功提高了柚皮素(28,41,71) 和花青素的产量。(30)

脂肪酸的生物合成与乙酰辅酶A的可用性和转化紧密相关，乙酰辅酶A是细胞代谢的核心代谢物。乙酰辅酶A主要在细胞质中生成，经历各种代谢转化，包括通过乙醛酸循环转化为C4有机酸。在脂肪酸生物合成途径中，三酰甘油酰基转移酶（DGA1）和甘油-3-磷酸脱氢酶（GPD1）是催化关键反应的关键酶。此外，柠檬酸合酶（CIT2）参与乙醛酸循环中乙酰辅酶A的分解。为了规避这些酶所构成的竞争途径，使用胞嘧啶碱基编辑技术同时删除GPD1、DGA1和CIT2。(72) 这一靶向干预使得从甘油生成柚皮素的产量显著增加了1.8倍。

对于莽草酸途径，主要的副产物是苯乙醇，该化合物是通过苯丙酮酸脱羧酶催化生成的。Aro10和Pdc5是酿酒酵母中的两种不同同工酶，敲除它们已被证明能显著提高黄酮类产量。(22,40,73) 例如，在酿酒酵母中同时敲除ARO10和PDC5可显著提高细胞内酪氨酸水平，增加了5.7倍。因此，这一遗传操作使柚皮素的产量提高了4.2倍。(40) 这些研究强调了微生物宿主中代谢途径的复杂相互作用，并突显了合成生物学工具如RNAi和CRISPRi的多样性。

3.7. 缓解中间体和产物的运输限制

亚细胞和胞外运输过程的复杂调控对酵母黄酮类生物合成的代谢效率有深远影响。优化的运输机制对于最小化碳流浪费和提高目标化合物的合成至关重要。转运体工程涉及膜转运蛋白的调控。如上所述，前体丙二酰辅酶A可以通过柠檬酸途径合成。在该途径中，来自线粒体TCA循环的柠檬酸需要高效运输到细胞质中以维持丙二酰辅酶A的最佳碳流。在酿酒酵母中，柠檬酸跨线粒体膜的运输涉及两个柠檬酸转运蛋白：柠檬酸转运蛋白基因CTP1 (74) 和线粒体载体蛋白基因YHM2。(75) 在酿酒酵母HB50菌株中仅过表达这两个基因即可使柚皮素的产量显著增加23.6%。(41)

除了前体的亚细胞运输，全面了解中间体和黄酮类产物的整个细胞运输过程是必要的。最近的研究揭示了细胞内外运输动态的复杂性，揭示了阻碍黄酮类最佳生产的潜在瓶颈。例如，Mao等的研究表明酵母细胞能高效导出对香豆酸，但也发现了问题：对香豆酸虽然被高效导出，但缺乏重新导入以用于后续柚皮素生物合成的能力。相反，柚皮素倾向于在细胞内积累，导致检测到的柚皮素产量较低。(62) 通过选择性增强PDR12等转运蛋白的表达（PDR12是已知能增强对芳香酸耐受性的ABC转运蛋白），显著提高了柚皮素的产量。(62) 此外，这种方法还具有减少不必要的对香豆酸积累的附加益处，从而简化了黄酮类生物合成途径。然而，具体机制尚待阐明，未来仍需发现更多参与中间体和黄酮类产物转运过程的转运蛋白。

此外，调控负责细胞膜形成的基因，如麦角固醇生物合成基因ERG9和ERG20，已被证明能增强酿酒酵母中柚皮素的外排，而不影响细胞生长，使得胞外柚皮素水平减少63.5%，同时共培养系统中总翠雀素产量提高了36.1%。(28) 因此，调节麦角固醇合成基因以增强膜通透性可能为缓解黄酮类运输限制提供替代方法。

图3. 增强酵母中黄酮类生产的途径优化策略。

(A) 加强核心黄酮类途径： (a) 将途径基因整合至油脂酵母26s rDNA位点；(b) 核心黄酮类途径的组合转录优化。

(B) 筛选与空间调控关键途径酶： (a) 从不同物种筛选CYP450家族酶（CYP/CPR）；(b) 通过定向进化获得具有优异催化活性的蛋白突变体；(c) 使用蛋白融合策略，通过使用刚性蛋白连接体或柔性蛋白连接体来缩短两酶之间的距离。

(C) 消除竞争途径：主要采用的生物技术是RNAi和CRISPRi。

3.5. 筛选与空间调控关键途径酶

3.5.1. 酶筛选与修饰

在下游黄酮类的生物合成中（图1，模块V），羟化酶如F3′H、FMO和F6H属于CYP450家族，需要细胞色素P450还原酶（CPR）来激活其催化活性。(66) 然而，CPR酶活性的限制构成了阻碍氧化还原反应的瓶颈。(27) 酶工程通过理性设计和半理性设计可以显著提高特定酶的催化效率。(67) 但该方法依赖于已知的酶结构，而CPR的精确结构以及羟化酶与CPR的相互作用模型的缺乏，给实施理性修饰带来了挑战。(68) 为解决这些障碍，研究探索了非理性策略（图3，部分B）。其中一种方法是从不同物种中筛选具有更高活性的同工酶，以提高黄酮类产量。例如，组合来自大花秋葵的GhF3′H和来自长春花的CrCPR，可实现最高的鼠李素产量（39.0 mg/L），柚皮素转化率达到73.7%。(33) 这种不同酶之间的协同作用提高了催化活性，增强了生物合成途径的流量，并提高了目标黄酮类产物的产量。与基因筛选不同，定向进化为提高酶活性和底物特异性提供了一种有针对性的方法，这对于优化代谢途径和提高产物产量至关重要。在最近的一项研究中，通过基于误差-PCR的定向进化获得了突变体SmF3′HD285N/SmCPRI453 V。此突变使得酿酒酵母中鼠李素的产量从805.6 mg/L显著提高至1054.5 mg/L，展示了定向进化在微调酶活性以改善产物合成方面的有效性。(69)

3.5.2. 途径酶的空间调控

除了酶筛选和定向进化外，调控相互作用酶的空间距离也被证明能改善酶之间的相互作用并提高催化效率。(70) 蛋白融合可以通过使用刚性连接体（如VDEAAAKSGR）或柔性连接体（如GGGS）使两酶之间的距离更近。为了测试蛋白融合策略在黄酮类生物合成中的可行性，在酿酒酵母中评估了几种AtC4H-连接体-At4CL的融合组合。结果显示，AtC4H-GGGS-At4CL方向在菌株I02中实现了最高的甘草素产量（77.7 mg/L），增加了107%。(27) 类似地，另一项研究发现，VvLAR-(GGGGS)2-FaDFR组合使儿茶素（一种黄烷-3-醇）的产量提高了8.7倍，相较于未使用蛋白融合的菌株。(59) 鉴于C4H和4CL调控对香豆酸的水平，而LAR和DFR催化花青素的不稳定中间体白花青素的生成和稳定，这些发现表明蛋白融合作为一种策略，可以平衡黄酮类生物合成途径中间体水平，从而提高整体产物产量。

3.6. 消除竞争途径

副产物的形成会阻碍碳代谢流，从而影响高水平生产的实现。一般而言，三条竞争途径参与黄酮类合成：(1) 争夺对香豆酰辅酶A的苯丙酸途径；(2) 争夺乙酰辅酶A的脂质生物合成途径和乙醛酸循环（GYC）；(3) 与莽草酸途径竞争的苯乙醇途径（图3，部分C）。减少副产物形成或防止重要前体降解的主要策略是敲除或下调这些途径中的关键基因。在酿酒酵母中，内源性双键还原酶Tsc13将对香豆酰辅酶A转化为副产物苯丙酸。然而，由于其在脂肪酸合成中的关键作用，Tsc13无法完全删除。研究表明，用苹果的同源物MdECR替代Tsc13是一种有效策略，成功提高了柚皮素(28,41,71) 和花青素的产量。(30)

脂肪酸的生物合成与乙酰辅酶A的可用性和转化紧密相关，乙酰辅酶A是细胞代谢的核心代谢物。乙酰辅酶A主要在细胞质中生成，经历各种代谢转化，包括通过乙醛酸循环转化为C4有机酸。在脂肪酸生物合成途径中，三酰甘油酰基转移酶（DGA1）和甘油-3-磷酸脱氢酶（GPD1）是催化关键反应的关键酶。此外，柠檬酸合酶（CIT2）参与乙醛酸循环中乙酰辅酶A的分解。为了规避这些酶所构成的竞争途径，使用胞嘧啶碱基编辑技术同时删除GPD1、DGA1和CIT2。(72) 这一靶向干预使得从甘油生成柚皮素的产量显著增加了1.8倍。

对于莽草酸途径，主要的副产物是苯乙醇，该化合物是通过苯丙酮酸脱羧酶催化生成的。Aro10和Pdc5是酿酒酵母中的两种不同同工酶，敲除它们已被证明能显著提高黄酮类产量。(22,40,73) 例如，在酿酒酵母中同时敲除ARO10和PDC5可显著提高细胞内酪氨酸水平，增加了5.7倍。因此，这一遗传操作使柚皮素的产量提高了4.2倍。(40) 这些研究强调了微生物宿主中代谢途径的复杂相互作用，并突显了合成生物学工具如RNAi和CRISPRi的多样性。

3.7. 缓解中间体和产物的运输限制

亚细胞和胞外运输过程的复杂调控对酵母黄酮类生物合成的代谢效率有深远影响。优化的运输机制对于最小化碳流浪费和提高目标化合物的合成至关重要。转运体工程涉及膜转运蛋白的调控。如上所述，前体丙二酰辅酶A可以通过柠檬酸途径合成。在该途径中，来自线粒体TCA循环的柠檬酸需要高效运输到细胞质中以维持丙二酰辅酶A的最佳碳流。在酿酒酵母中，柠檬酸跨线粒体膜的运输涉及两个柠檬酸转运蛋白：柠檬酸转运蛋白基因CTP1 (74) 和线粒体载体蛋白基因YHM2。(75) 在酿酒酵母HB50菌株中仅过表达这两个基因即可使柚皮素的产量显著增加23.6%。(41)

除了前体的亚细胞运输，全面了解中间体和黄酮类产物的整个细胞运输过程是必要的。最近的研究揭示了细胞内外运输动态的复杂性，揭示了阻碍黄酮类最佳生产的潜在瓶颈。例如，Mao等的研究表明酵母细胞能高效导出对香豆酸，但也发现了问题：对香豆酸虽然被高效导出，但缺乏重新导入以用于后续柚皮素生物合成的能力。相反，柚皮素倾向于在细胞内积累，导致检测到的柚皮素产量较低。(62) 通过选择性增强PDR12等转运蛋白的表达（PDR12是已知能增强对芳香酸耐受性的ABC转运蛋白），显著提高了柚皮素的产量。(62) 此外，这种方法还具有减少不必要的对香豆酸积累的附加益处，从而简化了黄酮类生物合成途径。然而，具体机制尚待阐明，未来仍需发现更多参与中间体和黄酮类产物转运过程的转运蛋白。

此外，调控负责细胞膜形成的基因，如麦角固醇生物合成基因ERG9和ERG20，已被证明能增强酿酒酵母中柚皮素的外排，而不影响细胞生长，使得胞外柚皮素水平减少63.5%，同时共培养系统中总翠雀素产量提高了36.1%。(28) 因此，调节麦角固醇合成基因以增强膜通透性可能为缓解黄酮类运输限制提供替代方法。

3.8. 动态控制与高通量筛选

3.8.1. 动态代谢工程

动态代谢调控使微生物宿主细胞能够根据外部和内部的代谢状态自发调节细胞生长和产物合成。对于酵母细胞工厂中增强黄酮类生物合成的需求，已经设计了多种动态控制系统来缓解宿主的代谢负担或平衡代谢中间体的含量。(62,76,77) 代谢依赖是一种将目标产物与细胞生长所需的必需化合物耦合的策略，用于防止工程微生物中产物合成表型的退化。在此背景下，Lv等设计了一个柚皮素-亮氨酸耦合系统，以增强在亮氨酸缺陷菌株中的柚皮素生产。(76) 具体而言，该代谢依赖系统与基于CRISPRi的脂肪酸诱导系统结合，后者负向调控脂质生成途径（图4，部分C）。结果表明，在324代后，经过基因改造的油脂酵母菌株保持了90.9%的初始柚皮素产量，同时柚皮素产量显著提高了74.8%。

图4. 通过缓解运输限制、高通量筛选和动态代谢调控提高酵母中黄酮类的生产。

(A) 缓解运输限制： (a) 过表达线粒体膜转运蛋白编码基因，缓解柠檬酸的运输限制；(b) 下调ERG9和ERG20的表达，减少细胞膜中麦角固醇含量，从而促进黄酮类化合物从酵母细胞中的运输。

(B) 基于FdeR和mCherry的高通量筛选系统，用于识别最佳的柚皮素生产菌株。

(C) 结合亮氨酸代谢补充与脂肪酸负自调节以增强柚皮素生物合成与细胞生长： (a) 所产的柚皮素诱导LEU2的转录，增强亮氨酸缺陷菌株的生长；(b) 副产物脂肪酸诱导dCas9-gRNA1-gRNA2-gRNA3的转录，其中gRNA引导dCas9靶向FAS1、FAS2和FabD并下调其表达。

FapR是一种基于转录抑制因子的丙二酰辅酶A生物传感器，(78) 它已与其他调控系统结合，以提高黄酮类的生产。例如，在酿酒酵母中构建了将FapR与CouR（一种对对香豆酰辅酶A响应的转录抑制因子）结合的双动态控制系统。(77) 该系统旨在上调4CL途径基因的表达，使柚皮素的产量在非调控条件下显著提高了15倍。此外，涉及FapR系统与基于RNAi系统的协同方法被设计用于动态调控关键酶的表达，解决对香豆酸积累和脂肪酸形成问题。(62) 这一整合导致柚皮素产量显著增加25%，同时维持了细胞生长。总的来说，动态代谢工程为提高酵母中黄酮类生产提供了一种高效、简化的方法，避免了手动过程监控和外部诱导剂补充的需求。

3.8.2. 高通量筛选

高通量筛选（HTS）依赖于生物传感器设计，将目标化合物浓度转化为可检测的信号。这种方法使得能够从庞大的合成文库中高效筛选出高产菌株。例如，基于FdeR（来源于草螟束孢菌的柚皮素响应转录调节因子）和mCherry（荧光蛋白）的生物传感器已被设计用于筛选高水平柚皮素生产的酿酒酵母菌株（图4，部分B）。(79) 具体而言，转录抑制因子FdeR与mCherry基因启动子的FdeO位点相互作用，抑制基因表达。柚皮素与FdeR结合的亲和力高于FdeO，从而解除抑制并激活mCherry表达。该机制使得可以使用荧光强度作为柚皮素产量的替代指标，从而高效筛选出高产柚皮素菌株。通过进一步优化关键组分，如核定位信号（NLS）、转录因子（TF）和启动子强度，该生物传感器可从通过Golden Gate组装获得的2500种组合中精确检测到预期的菌株。

开发用于高效筛选目标菌株的生物传感器以及用于构建突变文库的高级诱变技术，使得能够以更高的效率和精度识别出高产黄酮类菌株。最近，一种基于大气室温等离子体（ARTP）诱变的策略已与生物传感器技术结合，实现了快速和系统的筛选。(80) 这一整合策略利用ARTP诱变来在酵母群体中引入遗传多样性，同时生物传感器能够精确检测出所需的特性，如增强的柚皮素产量。因此，这些方法的结合从9600个突变体中分离出了显著提高柚皮素产量的突变菌株，展示了生物传感器引导选择和高通量诱变在酵母代谢工程中的潜在协同效应。

4. 酵母细胞工厂中黄酮糖苷生物合成的问题及相应解决方案

黄酮类的糖基化显著提高了其溶解性和稳定性，扩大了其在食品和制药领域的潜在用途。这种修饰由UDP-糖基转移酶（UGTs）介导，催化来自UDP-活化糖供体的糖基与黄酮类底物的结合，形成糖苷键。尽管糖基化的重要性，酵母中高效生产黄酮糖苷仍然是一项挑战，阻碍了其工业规模化应用。主要障碍包括黄酮糖苷的内源性降解、UGTs的底物广谱性和糖基供体的供应不足。为解决这些问题，已设计了多种策略，旨在提高酵母细胞中黄酮糖苷合成的产量和整体效率。

4.1. 解决黄酮糖苷内源性降解问题

酵母中的内源性葡萄糖苷酶可水解糖苷键，对所需黄酮糖苷的生物合成构成重大挑战。(81) 一种有效策略是识别并敲除负责这种水解的关键葡萄糖苷酶基因。在酿酒酵母中，葡萄糖苷酶如EXG1、SPR1和YIR007W已知在黄酮糖苷的降解中起作用。(82) 例如，敲除EXG1已被证明可防止多种黄酮糖苷的降解。(30,82,83) 特别是在酿酒酵母W303-1b菌株中，这一策略使得在96小时的培养过程中未发生糖苷水解，并增加了黄芩苷的产量。(83) 然而，这种方法并非在所有酵母物种中都有效。在油脂酵母中，敲除类似的葡萄糖苷酶基因（EXG2、BGL1和BGL2）并未提高黄芩苷的产量，(18) 表明不同的黄酮糖苷可能会被不同的水解酶靶向，并且不同物种中同工酶的活性存在差异。此外，发酵过程中增加葡萄糖浓度已被发现可以通过减少酵母对非糖底物的依赖性，从而减轻这些化合物的降解，进而促进油脂酵母中黄酮糖苷的生物合成。(18) 这些发现强调了为不同酵母物种量身定制的方法在优化黄酮糖苷生产中的必要性。

4.2. 减少UGTs底物广谱性引起的副产物积累

UDP-糖基转移酶（UGTs）的特异性对于黄酮糖苷的高效生产至关重要，这简化了下游的纯化过程。然而，许多UGTs表现出低底物特异性，在合成如矢车菊素3-O-糖苷(30) 和黄芩苷等化合物时会导致副产物的积累。(18,84) 因此，提高这些酶的特异性和催化效率是优化生产的关键。

一种方法是通过工程化UGTs以减少其底物广谱性，从而最小化副产物的形成。最近的研究表明，UGTs中关键催化残基的物理和化学参数可能控制异黄酮的位点特异性糖基化。(85) 因此，识别和修饰UGTs的关键催化残基预计可以提高底物特异性，其在黄酮类生物合成中的应用仍有待探索。另一种策略是提高途径上游酶的催化活性，如羟化酶，以确保更高效地将前体转化为目标糖苷。例如，通过酶筛选提高CYP450酶F6H的活性，可通过与UGTs竞争公共底物来增强黄芩苷的生物合成。(84) 此外，优化酶促反应的条件，特别是需要分子氧的酶（如F6H），(86) 对提高目标糖苷的产量至关重要。研究表明，通过改善发酵过程中溶解氧浓度（DOC）等参数，可显著增加目标黄酮糖苷的产量。(87) 这种方法确保酶活性处于最佳水平，从而提高整体的生物合成效率。此外，通过在油脂酵母中表达活性线虫血红蛋白(88) 来增强酵母细胞的氧吸收能力，也已被证明可改善有氧反应并提高黄芩苷的产量。(18) 这些策略共同强调了精细调整酶活性和发酵条件在微生物生产系统中实现更高黄酮糖苷产量和纯度的重要性。

4.3. 增强UDP-糖的供给

尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glu）和尿苷二磷酸鼠李糖（UDP-Rha）是黄酮糖苷合成中的直接糖基供体，但其在酵母中的内源性生成不足以支持高水平的生产。(19,89) 为缓解这一瓶颈，已实施了多种策略。

UDP-Glu生物合成途径的关键酶包括磷酸葡糖变位酶（PGM1或PGM2）和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGP1）。PGM将葡萄糖-6-磷酸转化为葡萄糖-1-磷酸，随后由UGP1将其转化为UDP-Glu。研究表明，在酿酒酵母中过表达PGM1/PGM2和UGP1可显著提高黄酮糖苷的产量，如黄芩苷，(83) 葛根素，(27) 和柚皮苷，(90) 其中葛根素的产量相比对照组显著增加了61%。另一有效策略是构建UDP-糖循环系统。在植物中，UDP-Rha通过UDP-鼠李糖合酶（RHM）的作用合成，该酶包含两种酶活性：UDP-葡萄糖4,6-脱水酶和UDP-4-酮-鼠李糖4-酮还原酶。这些酶分别需要NAD+和NADPH作为辅因子。通过构建一个将NADPH依赖性酶替换为NADH依赖性酶的融合蛋白，可以创建一个NADH循环系统，从而维持UDP-Rha的持续生产。该创新方法已被证明显著增强了黄酮-7-O-二糖苷的生物合成，如柚皮苷。(90)

除了上述策略外，独立UDP-糖合成途径的重建和碳共利用已被应用于增强异鼠李素和槲皮素3-O-半乳糖苷在大肠杆菌中的高水平生产，(91,92) 并可能在工程化酵母中也具有可行性。

5. 其他后修饰和复杂黄酮衍生物的生物合成

5.1. 异戊二烯基化

异戊二烯基黄酮的生物合成涉及通过异戊二烯基转移酶（PTs）将异戊二烯基供体（如二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）、法呢基焦磷酸（FPP）和GPP）的异戊二烯基转移到黄酮化合物上。其中一个显著例子是8-异戊二烯基柚皮素（8-PN），它具有强效植物雌激素活性，并在治疗女性激素失调方面具有治疗潜力。(93,94) 参与8-PN合成的关键PTs包括来自苦参的SfN8DT-1 (95) 和SfFPT (96)，以其对柚皮素和DMAPP的高特异性而闻名。近年来，在酿酒酵母中实现了8-异戊二烯基柚皮素的从头生产。采用的策略包括整合具有更高底物亲和力的PTs、通过截短形式的3-甲基戊二酸单酰基辅酶A还原酶（tHMG1）增强DMAPP供给，并过表达途径酶以增加柚皮素的产量。最终，8-异戊二烯基柚皮素在葡萄糖培养基中的产量达到0.12 mg/L。(97) 进一步的生产改进涉及代谢和蛋白质工程方法。(98) 具体而言，通过增加关键途径基因如tHMGR和IDI1的拷贝数来加强甲瓦龙酸（MVA）途径显著提高了DMAPP池，导致8-异戊二烯基柚皮素产量增加了368.8%。此外，通过序列比对和诱变开发的改良PT变体SfN8DT-1Q12E, N305M进一步促进了产物形成。通过放大发酵优化，在5升生物反应器中最终实现了101.4 mg/L的8-异戊二烯基柚皮素产量，这是迄今为止在微生物系统中报道的最高产量。(98) 总体而言，整合多种合成生物学策略和发酵技术在增强异戊二烯基黄酮的生物合成方面具有巨大潜力。

5.2. 甲基化

甲基化黄酮的合成是由O-甲基转移酶（OMT）酶催化的，使用S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，是黄酮类生物合成中的重要研究领域。黄芩素A是一种著名的甲基化4'-脱氧黄酮，因其抗病毒和抗癌特性而受到关注，(99,100) 其通过黄芩苷的6-甲基化合成。目前，黄芩素A主要来源于植物提取，限制了其商业供应。最近的进展展示了在毕赤酵母中生产黄芩素A的潜力，通过优化酶活性、维持接近中性的pH值、补充乙醇以增强细胞对肉桂酸的耐受性等策略，结合使用乙醇诱导和持续转录信号放大装置，黄芩素A的产量达到339.5 mg/L。(101) 类似地，樱草素是一种从柚皮素衍生的甲基化黄酮，被认为在水稻防御昆虫食害方面发挥作用。(102) 在酿酒酵母中生产樱草素的工程涉及增加关键途径基因（HaTAL、PhCHS和OsNOMT）的拷贝数，并优化芳香族氨基酸和丙二酰辅酶A的前体途径。该方法使樱草素产量显著增加至50.6 mg/L，并在1升生物反应器中进一步优化，提升至158.7 mg/L。(103) 这项研究代表了樱草素在酿酒酵母中从头合成的首次实现，其他如油脂酵母和毕赤酵母的潜在优势仍有待开发。

5.3. 复杂黄酮衍生物的合成

除了单一后修饰，涉及多重后修饰的复杂黄酮化合物的生物合成在酵母细胞工厂中也得到了探索。淫羊藿素（ICT）是一种异戊二烯基化和甲基化的黄酮醇，具有多种治疗功能，如治疗肝细胞癌、治疗骨质疏松症和诱导白血病细胞凋亡。(104,105) 淫羊藿素的合成涉及对山奈酚的8-C-异戊二烯基化和4'-O-甲基化。淫羊藿素合成的一个问题是PTs和OMTs在细胞质中低pH环境下的活性有限。为了解决这一问题，已应用细胞区隔化（将酶重新定位至线粒体）以提高这两种后修饰酶的催化活性，(106,107) 因为线粒体内的pH相对较高。

淫羊藿苷（ICA）是通过对淫羊藿素进行3-O-鼠李糖基化和7-O-葡萄糖基化而合成的。为了在工程酵母中实现淫羊藿苷的合成，采用了多方面的方法。(107) 后修饰酶，包括8-C-异戊二烯基转移酶、4'-O-甲基转移酶、3'-O-鼠李糖基转移酶和7-O-葡萄糖基转移酶，分别来自不同物种以完成所需的后修饰步骤。为解决二氢山奈酚积累的问题，使用RIAD-RIDD肽将F3H和FLS融合为一体。过表达ARO4K229L、ARO7G141S和ACC1基因以提高芳香族氨基酸和丙二酰辅酶A的供给。进一步的改进包括截短8-C-异戊二烯基转移酶的87个N端氨基酸以提高活

性，过表达tHMG1和IDI1以增加DMAPP的生产，并将8-C-异戊二烯基转移酶定位至线粒体以减轻低pH的影响，使得8-异戊二烯基山奈酚的产量达到12.9 mg/L。为了进一步优化淫羊藿苷的生产并减少副产物，实施了三级层次动态调控系统。该系统使用对不同底物响应的启动子来控制后修饰酶的顺序表达。最终，这些策略使得酿酒酵母在以葡萄糖为底物的条件下实现了130 μg/L的淫羊藿苷产量，展示了整合多种工程策略在黄酮后修饰方面的有效性，并为阐明和重建酵母细胞工厂中复杂黄酮生物合成途径提供了洞见。

6. 讨论与展望

工程化酵母细胞工厂（如酿酒酵母、油脂酵母和毕赤酵母）的进展凸显了它们在提高黄酮类及其衍生物生产中的潜力。通过利用一系列系统工程策略，部分生产瓶颈已被缓解。然而，目前的生产水平仍不足以满足工业应用，且仍存在诸多未解决的问题。一个显著障碍是关键酶如CHS和CYP450家族酶的催化活性低下，即便采用了蛋白融合和酶筛选技术。解决此问题需要进一步探索酶工程，包括通过蛋白质工程和定向进化进行的理性和非理性修饰。理性和半理性设计是酶工程中的两种基本方法，它们依赖于对酶的三维结构及结构–活性关系的详细机制的全面理解。(108) 对于CYP450家族的酶，理性和半理性设计通常靶向底物识别位点、底物进入通道以及与P450-氧化还原伙伴的相互作用位点中的关键残基。(109,110) 理性和半理性设计已成功提升了CYP450家族酶（如CYP105AS1 (111) 和CYP105A1 (112)）的催化活性。具体来说，通过三轮位点饱和诱变获得了CYP105AS1的突变体P450Prava (I95T/Q127R/A180 V/L263I/A265N)，其Km值降低了21倍；将CYP105A1底物进入通道中的两个精氨酸残基（Arg-73和Arg-84）突变为非极性的丙氨酸，使得酶活性相比野生型酶提高了400倍。此外，黄酮类的运输限制和低水溶性也限制了其工业应用。目前，转运体工程的研究仍处于早期阶段，需要进一步挖掘和表征相关的转运蛋白，并深入了解其功能机制。最近的研究显示，糖基化修饰能够增强黄酮类的胞外分泌，使得酿酒酵母中的柚皮素产量提高了7.9倍，(113) 表明后修饰在黄酮类合成中的多功能潜力。

与有目的地调节细胞代谢流向目标产物不同，高通量筛选（HTS）能够在没有详细了解特定机制的情况下快速识别菌株库中的目标菌株。然而，目前已建立的HTS方法主要针对对香豆酰辅酶A、对香豆酸和柚皮素，亟需更为通用的针对特定黄酮类产品的HTS系统。机器学习（ML）和深度学习（DL）在合成生物学的设计-构建-测试-学习（DBTL）框架中提供了另一种有前景的方法。ML/DL算法可以识别大量数据集中的模式，预测基因改造对黄酮类产量的影响。这种预测能力促进了通过迭代优化循环创建高效微生物细胞工厂。最近，ML驱动的策略在仅两个DBTL周期内就使得对香豆酸产量提高了68%，(114) 显示了机器学习算法在预测和快速获得高产菌株方面的优势。此外，结合瓶颈-解除瓶颈策略和基于ML的启动子工程在大肠杆菌中实现了3.65 g/L的柚皮素产量。(115) 具体而言，通过在低拷贝质粒上使用弱启动子表达个体柚皮素基因设计了一个人工柚皮素途径瓶颈，然后通过筛选能够产生与原始途径相似的柚皮素产量的候选突变体消除新设计的柚皮素途径瓶颈。结合ML介导的启动子工程，进一步平衡了代谢流量。这些研究表明，使用机器学习算法预测高产菌株或快速优化参与黄酮类合成的途径基因的进化路径是可行的。未来，ML/DL介导的策略可进一步应用于途径设计优化，能够快速预测和优化酵母代谢途径中的瓶颈和约束，或整合多组学数据，以促进代谢工程的整体方法，并通过预测大规模合成的最佳条件推动可扩展生产工艺的发展。

在黄酮类的后修饰及复杂黄酮化合物的合成方面，应更加关注后修饰酶（UGTs、PTs和OMTs）的表征和工程化，以及增强基团供体（如UDP-糖、DMAPP和SAM）的供应。例如，通过平衡AAAs、丙二酰辅酶A和DMAPP的生物合成途径流量，并通过pH控制和酶截短等方法对PTs进行工程化，已实现了在酿酒酵母中首次从头生产黄腐酚。(116) 此外，阐明复杂黄酮类途径的合成路径并将其模块化构建在工程酵母中，特别是非传统酵母中，预计将取得显著成果。系统和合成生物学工具的发展允许对代谢网络进行全面优化，利用基因组规模的代谢模型和代谢组学进行细胞代谢的整体、空间和动态调控，并有助于合理调控细胞整体代谢并增强复杂黄酮类衍生物的生产。(117,118) 此外，由ML算法驱动的数据驱动合成生物学能够处理庞大的实验数据，以发现传统方法可能错过的复杂关系，从而进一步增强对合成生物学系统的理解和控制。

综上所述，通过先进技术和创新策略应对当前挑战，为工程化酵母细胞中的黄酮类工业规模生产铺平了道路，为生物技术的进步和天然产物的生物合成开辟了新的机遇。